程香 孫霞 劉英光

【摘 要】2016年，中國(guó)心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病。腦血管病、冠心病、外周動(dòng)脈疾病等血管性疾病在心血管病中占據(jù)著重要地位。離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是研究血管舒縮功能的一種實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)對(duì)血管舒縮功能研究，探討血管疾病的本質(zhì)，從而為心血管疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。本文從離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介、實(shí)驗(yàn)設(shè)備、實(shí)驗(yàn)步驟及實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)等方面進(jìn)行闡述，希望對(duì)即將開(kāi)展該實(shí)驗(yàn)的研究人員提供一些幫助。

【關(guān)鍵詞】離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn);血管功能;收縮;舒張

中圖分類號(hào)： TH776.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 2095-2457（2019）23-0220-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.23.104

【Abstract】In China， Cardiovascular Disease（CVD） was the leading cause of death in 2016， more than tumors or any other diseases.Cerebrovascular disease， coronary heart disease， and peripheral arterial disease occupy an important position in cardiovascular disease.The vascular ring experiment in vitro is an experimental method for the study of vasomotor contraction and relaxation.Through the study of vasomotor function， the nature of vascular diseases is explored to provide a scientific basis for the prevention and treatment of cardiovascular diseases. This article describes the introduction， devices， procedures and experience of the vascular ring experiment in vitro， hoping to provide some helps for researchers to conduct the experiment.

【Key words】The vascular ring experiment in vitro; Vascular function; Contraction; Relaxation

心血管系統(tǒng)疾病是世界范圍內(nèi)死亡的主要原因，但其發(fā)病機(jī)制尚不清楚[1]。調(diào)查顯示，2016年，中國(guó)心血管病死亡率居首位，高于腫瘤及其他疾病，占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上。腦血管病、冠心病、肺血管病及外周動(dòng)脈疾病等血管性疾病在心血管病占據(jù)著重要地位[2]。離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是研究血管舒縮功能的一種實(shí)驗(yàn)方法，是研究血管生理學(xué)、病理生理學(xué)和藥理學(xué)的重要手段[3]。通過(guò)對(duì)血管舒縮功能研究，探討血管疾病的本質(zhì)，從而為心血管疾病的防治提供科學(xué)依據(jù)。本文第一作者有幸作為“2018年中西部高等學(xué)校青年骨干教師國(guó)內(nèi)訪問(wèn)學(xué)者”，于2018年9月到西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)與病理生理學(xué)系進(jìn)行為期10個(gè)月的訪問(wèn)學(xué)習(xí)，期間跟隨心血管病理生理學(xué)研究團(tuán)隊(duì)，參與了大鼠、小鼠離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)，現(xiàn)就該實(shí)驗(yàn)基本內(nèi)容、實(shí)驗(yàn)設(shè)備與器材、實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)和在該實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)驗(yàn)等闡述如下。

1 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介

離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是研究血管舒縮功能的一種實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)裝置不斷推陳出新，目前使用較廣泛的是DMT620多通道離體微血管張力測(cè)定系統(tǒng)（丹麥）（圖1）。首先分離血管，清除周圍結(jié)締組織和脂肪組織，切成2-3mm長(zhǎng)的血管環(huán)，再用金屬絲或鎢絲穿過(guò)血管環(huán)并懸掛于張力浴槽內(nèi)，連接張力換能器和計(jì)算機(jī)，測(cè)定并記錄離體血管的舒縮活動(dòng)，常用于研究大鼠腸系膜動(dòng)脈[4]、大鼠腦基底動(dòng)脈[5]、小鼠腸系膜動(dòng)脈[6]、小鼠主動(dòng)脈、髂動(dòng)脈、頸動(dòng)脈、腎動(dòng)脈[7]等微小血管的功能。

2 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)設(shè)備、器材

離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)所需設(shè)備、器材包括：（1）動(dòng)物解剖臺(tái);（2）手術(shù)解剖顯微鏡;（3）DMT620多通道離體微血管張力測(cè)定系統(tǒng);（4）氧氣瓶;（5）微型真空泵;（6）培養(yǎng)皿;（7）水浴鍋;（8）常用動(dòng)物手術(shù)器械;（9）移液器等。

3 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)步驟及操作注意事項(xiàng)

（1）打開(kāi)儀器設(shè)備，檢查儀器狀態(tài)。

（2）在DMT620多通道離體微血管張力測(cè)定系統(tǒng)張力浴槽內(nèi)填充5ml預(yù)冷的（4℃）Krebs-Henseleit溶液（KHS），KHS成分（濃度/mM）：NaCl115，NaHCO325，KCl 4.6，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl22.5，Glucose.H2O10，充95%O2+5%CO2后用NaOH調(diào)至pH7.4[8]。注意此時(shí)不可加熱。

（3）處死動(dòng)物，解剖并分離組織，輕輕取出擬研究的血管組織，放置于含預(yù)冷的（4℃）KHS的容器中，稍微沖洗血管表面及管腔內(nèi)部分血液。

（4）將血管組織轉(zhuǎn)移至含預(yù)冷的（4℃）KHS的專用培養(yǎng)皿中，輕輕撐開(kāi)血管并分離血管表面的脂肪及結(jié)締組織等，盡量分離干凈。

（5）剪切一段長(zhǎng)約2mm的血管環(huán)，建議取中間段的或分支，兩端的不要。

（6）將一根血管環(huán)轉(zhuǎn)移至一個(gè)張力浴槽中。用金屬絲（40μm）或鎢絲（25μm）穿過(guò)血管環(huán)固定于張力浴槽內(nèi)。

（7）血管環(huán)固定好后檢查兩根絲的位置，調(diào)至平行狀態(tài)，血管環(huán)處于松弛狀態(tài)，不受力。

（8）將固定有血管環(huán)的張力浴槽放置于主控制器面板上，插上傳感器連接線。

（9）打開(kāi)通氣，使氣泡一個(gè)接一個(gè)冒出，打開(kāi)加熱，升溫至37℃。

（10）待溫度上升至37℃后，拉至初始預(yù)張力。小鼠胸主動(dòng)脈約5mN，大鼠腸系膜動(dòng)脈約3mN。在此基礎(chǔ)上，可根據(jù)血管粗細(xì)適當(dāng)調(diào)整。

（11）更換5mL 37℃預(yù)熱通氣的KHS，開(kāi)始平衡，平衡過(guò)程中每隔20min換一次張力浴槽內(nèi)的溶液。平衡總計(jì)60min。在平衡過(guò)程中，每隔5min左右旋轉(zhuǎn)螺旋尺調(diào)節(jié)初始值，使張力始終維持在最佳初始值附近即可。

（12）打開(kāi)電腦軟件，開(kāi)始記錄。

（13）調(diào)零（Zero）。排空浴槽中的KHS。排空后，立即加入5ml 60mM的高鉀Krebs-Henseleit溶液刺激血管并添加注釋，刺激到上升至平臺(tái)期。60mM的高鉀KHS成分（濃度/mM）：NaCl63.7，NaHCO315，KCl60，NaH2PO4.2H2O1.2，MgCl2.6H2O1.2，CaCl21.5，Glucose.H2O 5.5，充95% O2+5%CO2后用NaOH調(diào)至pH7.4。

（14）使用37℃預(yù)熱充氣的KHS洗脫至基線。等待10min后再進(jìn)行刺激。

（15）排空浴槽中的KHS。立即加入5ml 60mM的高鉀KHS第二次刺激并添加注釋，刺激到上升至平臺(tái)期。按上一步驟的方法洗脫血管至基線。

（16）等待15min，添加1μM（5μL 1×10-3M至5mLKHS）收縮劑（去甲腎上腺素或苯腎上腺素），刺激至平臺(tái)期，并維持在平臺(tái)。

（17）添加乙酰膽堿10μM（5μL 1×10-2M至5mLKHS）。舒張2min。觀察血管舒張程度，血管能夠舒張至85%以上，表明血管內(nèi)皮功能完好。

（18）如果需要做量效曲線，可以直接加收縮藥，逐漸增加乙酰膽堿或其他舒張藥的濃度，觀察舒張曲線。

（19）用37℃預(yù)熱充氣的KHS洗脫血管3次，每次15min。

（20）根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，用藥物孵育血管（15min）或不孵育，添加收縮劑，待收縮至平臺(tái)期，濃度累積地加入不同的舒張藥，觀察舒張曲線。每組藥物之間均按上一步驟的方法洗脫血管。

（21）結(jié)束實(shí)驗(yàn)，保存文件。

（22）清洗儀器。

4 離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)的體會(huì)

離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)比較耗時(shí)，從分離血管到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，少則4-5h，多可達(dá)10h以上，非常考驗(yàn)實(shí)驗(yàn)人員的耐心。通過(guò)幾個(gè)月的實(shí)驗(yàn)操作，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下，希望對(duì)今后開(kāi)展此實(shí)驗(yàn)的研究人員提供一些幫助。

1）在分離血管時(shí)，一定要有耐心，切勿過(guò)度牽拉血管，否則易使血管失去活性。分離血管是一項(xiàng)技術(shù)活，要想得到活性好的血管，一定要多練，可以先分離直徑較粗的胸主動(dòng)脈，再過(guò)渡到腸系膜2級(jí)或3級(jí)血管。血管離體后，不能干燥，必須放置于盛有KHS的容器內(nèi)。

2）血管分離后，將血管固定于張力浴槽時(shí)，注意勿損傷血管內(nèi)皮，我們的經(jīng)驗(yàn)是先穿過(guò)一根絲，固定到張力浴槽上，再穿第二根絲并固定。在穿第二根絲時(shí)，務(wù)必與第一根絲平行，不能有交叉。固定好后，要使血管處于松弛狀態(tài)，不受力。

3）血管固定好后，調(diào)至初始預(yù)張力后平衡血管也是非常重要的過(guò)程，此過(guò)程使血管逐步適應(yīng)離體環(huán)境，為后續(xù)血管功能測(cè)定奠定基礎(chǔ)，若血管未平衡好，在加藥時(shí)，血管會(huì)對(duì)藥物的反應(yīng)性差，影響實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。因此，在調(diào)初始張力時(shí)，為了使血管逐漸適應(yīng)，我們常常逐步升高張力，如初始張力為3mN，先調(diào)至0.5mN，穩(wěn)定數(shù)分鐘，再增加至1mN，穩(wěn)定數(shù)分鐘，直至到3mN。

4）加藥時(shí)，合理掌握加藥時(shí)間是極為重要的。（1）在加入收縮劑后，一定要達(dá)到收縮平臺(tái)期后才能加舒張藥，否則可能出現(xiàn)加入舒張藥后，張力還繼續(xù)升高的情況，無(wú)法分析到底是收縮劑還是舒張藥的作用。（2）不同的血管，加藥時(shí)間、間隔不能一概而論，實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，加入相同濃度的苯腎上腺素，小鼠腸系膜動(dòng)脈達(dá)到收縮平臺(tái)期時(shí)間明顯短于小鼠胸主動(dòng)脈，故加藥時(shí)間應(yīng)相應(yīng)縮短。（3）即使是相同類型的血管，由于不同浴槽內(nèi)血管的反應(yīng)性不同，也應(yīng)認(rèn)真觀察，合理掌握加藥時(shí)間，同為小鼠胸主動(dòng)脈，同時(shí)加入相同濃度的苯腎上腺素后，如第一個(gè)浴槽內(nèi)血管最先到達(dá)收縮平臺(tái)期，則應(yīng)先加舒張藥至此浴槽，以此類推。

5）有時(shí)，血管張力曲線不穩(wěn)定，要注意分析原因。如第一次加收縮藥時(shí)，血管收縮不理想，可能血管未平衡好，還未較好地適應(yīng)離體環(huán)境，可用37℃預(yù)熱充氣的KHS洗脫血管后，再平衡一段時(shí)間。

總之，做離體血管環(huán)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)非常艱辛的過(guò)程，不僅要敢吃苦，還要善于開(kāi)動(dòng)腦筋，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，合理優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中要耐得住性子，合理掌握加藥時(shí)間，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更能客觀反映血管本身的狀態(tài)及功能。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Zhang L，Wang Y，Li Y et al，Hydrogen Sulfide（H2S）-Releasing Compounds：Therapeutic Potential in Cardiovascular Diseases[J].Front.Pharmacol.9：1066.doi：10.3389/fphar.2018.01066.

[2]胡盛壽，高潤(rùn)霖，劉力生，等.《中國(guó)心血管病報(bào)告 2018》概要（R），中國(guó)循環(huán)雜志 2019 年 3 月 第 34 卷 第 3 期（總第 249 期）.

[3]介紹一種離體血管環(huán)的實(shí)驗(yàn)裝置和方法[J].劉沙、蕭明第、薛松、盧成寶，《醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)》，2002 年6月，第15卷 第3期，199-203.

[4]Wang XF， Cheang WS， Yang HX et al， Nuciferine relaxes rat mesenteric arteries through endothelium-dependent and-independent mechanisms[M]，British Journal of Pharmacology， （2015） 172 5609-5618.

[5]Yu Wei， Wang Yan， Song Zheng， Zhao Li-Mei， Li Gui-Rong， Deng Xiu-Ling.Equol increases cerebral blood flow in rats via activation of large-conductance Ca2+-activated K+ channels in vascular smooth muscle cells[M]，Pharmacological Research， http：//dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2016.03.015.

[6]Yang GD，Wu LY，Jiang B et al，H2S as a Physiologic Vasorelaxant： Hypertension in Mice with Deletion of Cystathionine γ-Lyase[M].Science.2008 October 24; 322（5901）： 587–590. doi：10.1126/science.1162667.

[7]Oliver BARETELLA， Sookja K CHUNG， Aimin XU et al，Endothelial overexpression of endothelin-1 modulates aortic， carotid， iliac and renal arterial responses in obese mice[M].Acta Pharmacologica Sinica （2017） 38： 498–512.

[8]Wang Y，Sun HY，Liu YG et al，Tyrphostin AG556 increases the activity of large conductance Ca2+-activated K+ channels by inhibiting epidermal growth factor receptor tyrosine kinase[M].J. Cell. Mol. Med. Vol 21， No 9， 2017 pp. 1826-1834.