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        銀屑平丸對小鼠銀屑病樣模型血清白細胞介素-18和白細胞介素-22表達的影響

        2019-09-28 03:24:04彭丹李小鵬席建元謝汶芳
        關(guān)鍵詞:小鼠劑量實驗

        彭丹,李小鵬,席建元,謝汶芳

        (湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南長沙410007)

        近年來大量研究表明,免疫機制的異常在銀屑病的發(fā)病過程中起著重要的作用。由于免疫機制的調(diào)節(jié)主要是通過多種細胞因子之間相互作用來實現(xiàn),因此細胞因子網(wǎng)絡(luò)在銀屑病發(fā)病機制中的作用已成為銀屑病研究的熱點之一。前期筆者發(fā)現(xiàn)白細胞介素(IL)-17和IL-23與銀屑病樣小鼠模型的銀屑病面積和嚴重程度指數(shù)(PASI)評分呈正相關(guān),且銀屑平丸可以明顯降低銀屑病樣小鼠模型血液中這2個因子的含量[1]。本研究在前期的工作基礎(chǔ)上,通過IL-18和IL-22這2種重要的炎癥介質(zhì),進一步探討銀屑平丸干預銀屑病的可能機制,評價銀屑平丸對銀屑病的治療作用。

        1 材料與方法

        1.1 實驗材料

        1.1.1 實驗動物 48只健康的SPF級雌性的BALB/c小鼠,體質(zhì)量 18~20 g,周齡 8~12 周,來源于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供[動物許可證號:SCXK(湘)2011-0003。編號:NO.43004700003224]。小鼠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心。

        1.1.2 實驗藥物 銀屑平丸(組成:生地黃、牡丹皮、紫草、丹參、白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉、山藥、女貞子、旱蓮草、白鮮皮、甘草),60 g/瓶。功效:涼血養(yǎng)陰,活血解毒。主治:銀屑病,副銀屑病,紅皮病,毛發(fā)糠疹等皮膚病。由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室提供;雷公藤多苷片,湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司生產(chǎn),國藥準字號:Z43020138,規(guī)格:10 mg;5%咪喹莫特乳膏,湖北科益藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn),國藥準字號:H20040,規(guī)格:5 g。

        1.1.3 實驗試劑 IL-18和IL-22酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒由武漢博士德生物工程公司生產(chǎn);酶標儀、MoticB5顯微攝像系統(tǒng)、MIAS醫(yī)學圖象分析系統(tǒng)等實驗儀器設(shè)備均由湖南中醫(yī)藥大學實驗中心提供。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 動物造模 將48只小鼠用剃毛器剔除背毛,面積約3 cm×4 cm大小,除空白對照組小鼠外,余各組小鼠均用適量5%咪喹莫特乳膏外涂,1次/d,連續(xù)用藥8 d,末次給藥后24 h觀察小鼠背部皮損的變化,處死小鼠后取小鼠背部皮膚作病理生理切片。

        1.2.2 造模評價 末次給藥后觀察各組小鼠背部皮膚的變化,采用校正PASI評分法記錄各組小鼠背部皮膚PASI評分結(jié)果,處死小鼠后取小鼠背部皮膚用10%多聚甲醛溶液固定,作石蠟包埋、病理生理切片,常規(guī)HE染色,光鏡下評價小鼠皮膚病理生理變化。

        1.2.3 動物分組 將實驗組48只BALB/c小鼠采用隨機分組法分為6組,分別為:空白對照組、模型對照組、雷公藤多苷組、銀屑平丸高劑量組、銀屑平丸中劑量組、銀屑平丸低劑量組,8只/組。

        1.2.4 動物給藥 按臨床給藥標準,銀屑平丸患者臨床每日用量為45 g生藥,按照平均60 kg體質(zhì)量計算,患者平均用藥量為0.75 g/kg,按照常用實驗動物與人的體表面積比值表換算,高劑量組小鼠的灌胃劑量為12.98 g/kg,中劑量組小鼠的灌胃劑量為6.49 g/kg,低劑量組小鼠的灌胃劑量為3.25 g/kg。其中中劑量相當于臨床等效劑量,是高劑量的1/2,是低劑量的2倍。雷公藤多苷片,小鼠用量為臨床等效劑量,為10 mg/kg。

        將雷公藤多苷片溶于蒸餾水,配成藥物濃度為10 mg/kg的藥液,將銀屑平丸粉末與蒸餾水混合攪勻,配成藥物濃度分別為12.98、6.49、3.25 g/kg的藥液??瞻讓φ战M小鼠用0.4 mL生理鹽水灌胃,1次/d,62.5 mg凡士林乳膏背部外涂,1次/d;模型對照組小鼠用0.4 mL生理鹽水灌胃;雷公藤多苷組小鼠用0.4 mL雷公藤多苷溶液藥液灌胃;銀屑平丸高、中、低劑量組小鼠用0.4 mL高、中、低劑量銀屑平丸溶液藥液灌胃,1次/d,同時各組小鼠62.5mg5%咪喹莫特乳膏背部外涂,1次/d,連續(xù)給藥8 d。

        1.2.5 動物取材 末次給藥24 h后,采用摘取小鼠眼球取血法,每只小鼠取血0.8~1.0 mL,將血液立即在4℃下進行離心2 000轉(zhuǎn)/min共10 min后吸取上層血清,將其保存于-20℃,用于檢測細胞因子IL-18和 IL-22。

        1.2.6 細胞因子檢測 采用ELISA法對各組小鼠血清中細胞因子IL-18和IL-22進行檢測,操作步驟嚴格按照說明書進行,酶標儀檢測。

        1.3 統(tǒng)計學分析 運用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,完全隨機設(shè)計的單變量計量資料多樣本符合正態(tài)性和方差齊性采用單因素方差分析方法,不滿足正態(tài)性和方差齊性則采用Kruskal-WallisH檢驗進行分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 一般情況 在整個實驗過程中,小鼠在每天灌胃、涂藥前精神狀態(tài)均正常,飲水、飲食可,活動度正常,灌胃、涂藥后活動稍減弱,0.5 h后均恢復正常。

        2.2 小鼠血清IL-18、IL-22水平分析對比 模型組小鼠血清中IL-18、IL-22水平高于空白對照組小鼠及雷公藤多苷組和銀屑平丸組,雷公藤多苷組與銀屑平丸中、高劑量組IL-18、IL-22水平差異無統(tǒng)計學意義,與銀屑平丸低劑量組差異有統(tǒng)計學意義,銀屑平丸中、高劑量組IL-18、IL-22水平差異無統(tǒng)計學意義,與銀屑平丸低劑量組差異有統(tǒng)計學意義,表明雷公藤多苷及中、高劑量銀屑平丸可降低小鼠血清中IL-18、IL-22水平。見表1。

        表1 各組小鼠血清中IL-18、IL-22水平的檢測結(jié)果 (±s)

        表1 各組小鼠血清中IL-18、IL-22水平的檢測結(jié)果 (±s)

        注:與空白對照組比較*P<0.05;與模型對照組比較#P<0.05;與雷公藤多苷組比較▲P>0.05;與銀屑平丸中劑量組比較△P>0.05。

        組別 n IL-18(ng/mL) IL-22(ng/mL)空白對照組 7 113.98±21.22 107.32±32.05模型對照組 7 233.83±42.82* 244.53±40.45*雷公藤多苷組 6 165.51±26.12# 155.07±33.90#銀屑平丸中劑量組 6 158.29±20.23#▲ 162.68±29.08#▲銀屑平丸低劑量組 7 200.50±36.81# 202.08±33.42#銀屑平丸高劑量組 5 154.02±25.07▲△ 157.38±26.46▲△

        3 討論

        銀屑病是一種常見并易復發(fā)的慢性炎癥性、免疫性皮膚病,以紅斑和鱗屑為主要臨床特征。中醫(yī)學認為銀屑病的發(fā)病可辯證分型為血熱、血瘀、血燥,血熱是銀屑病發(fā)病的直接病因,血瘀是銀屑病發(fā)生發(fā)展的重要病理環(huán)節(jié),血燥傷陰是銀屑病的重要病因病機。針對銀屑病患者以血熱為主,極易挾瘀、挾毒、傷陰的特點,并根據(jù)現(xiàn)代藥理學,在犀角地黃湯的基礎(chǔ)上減去犀角,配伍了白花蛇舌草、半枝蓮、大青葉清熱解毒,丹參、紫草活血化瘀,女貞子、旱蓮草、山藥養(yǎng)陰潤燥,白鮮皮清熱祛風解毒,甘草調(diào)和諸藥,而制成銀屑平丸。全方共奏涼血養(yǎng)陰,活血解毒之功。前期研究銀屑平丸可能通過調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥因子產(chǎn)生、抗炎、改善微循環(huán)而達到治療銀屑病的作用[3-4];通過觀察37例尋常型銀屑病患者在銀屑平丸治療前后PASI評分以及檢測外周血清IL-2、干擾素(IFN)-γ的變化,認為銀屑平丸可改善銀屑病患者皮損且能降低銀屑病患者外周血清IL-2、IFN-γ的水平,從而進一步推斷銀屑平丸治療銀屑病的機制可能與調(diào)節(jié)患者免疫機制有關(guān)[5];通過實驗研究銀屑平丸對豚鼠銀屑病樣模型血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和腫瘤壞死因子(TNF)-α水平的影響,發(fā)現(xiàn)銀屑平丸可以降低豚鼠耳部組織勻漿中VEGF和TNF-α的表達水平,再一次證實銀屑平丸可以調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng),同時還可以抗新生血管生成,從而對銀屑病發(fā)揮治療作用[6]。

        IL-18屬于Th1類細胞因子,是一種新型的細胞因子,其主要由吞噬細胞分泌,對慢性炎癥性疾病有著重要的作用。IL-18可直接刺激NK細胞,促進INF-γ的合成,激活淋巴細胞和巨噬細胞,促進IL-2、TNF-α、IFN-γ 等 Th1 型細胞因子的分泌[7],同時還可以調(diào)節(jié)Th1細胞的分化發(fā)育[8]。IL-18的過度表達會通過作用于Th1細胞而增強FasL介導的細胞毒作用[9],從而啟動細胞凋亡。IL-18還能促進血管的生成,抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有學者發(fā)現(xiàn)尋常型銀屑病患者外周血清中IL-18及IFN-γ的表達水平顯著高于正常人,其濃度變化與PASI評分有相關(guān)性,且與IFN-γ水平呈正相關(guān)。以上研究不僅提示IL-18在銀屑病發(fā)病中有重要作用,還可認為其是銀屑病病情活動的指標之一[10]。

        IL-22同樣是一種重要的免疫細胞因子,IL-22可與IL-17協(xié)同促進角質(zhì)形成細胞表達IL-8以及CCL20,誘導炎癥細胞的浸潤,還能上調(diào)角蛋白17免疫調(diào)節(jié)因子的表達,使自身免疫性T細胞激活,誘導轉(zhuǎn)化Th細胞免疫應答類型,從而起到免疫調(diào)節(jié)作用[11],李雅琴[12]通過ELLSA檢測出IL-22在銀屑病患者外周血中的表達水平較健康人升高,且病情處于進行期時會高于靜止期,表明IL-22的表達水平與病情嚴重程度有相關(guān)性。

        本次研究發(fā)現(xiàn),IL-18和IL-22在咪喹莫特小鼠銀屑病樣模型和銀屑病患者外周血的異常表達是一致的,銀屑平丸能通過降低外周血清中IL-18和IL-22因子的表達水平,起到調(diào)節(jié)免疫的作用,從而達到治療銀屑病的目的,這為銀屑平丸的進一步開發(fā)提供了實驗基礎(chǔ)。

        但本次實驗未能檢測BALB/c小鼠背部皮膚中IL-18以及IL-22的表達水平,僅從小鼠外周血清中IL-18以及IL-22的表達水平來探討銀屑平丸治療銀屑病的發(fā)病機制,不夠全面。

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