劉琳 張燕 杜明鈺 馬潤(rùn)玫

摘要：目的? 比較陰栓檢查法、陰道涂片法和孕中期腹部觸診法判斷SD大鼠受孕的準(zhǔn)確性，為高效構(gòu)建SD孕鼠模型提供參考。方法? 于2018年1月～3月選取50只未生育過的雌性SPF級(jí)SD大鼠，9只SPF級(jí)雄性SD大鼠，隨機(jī)交配后分別用陰栓檢查法、陰道涂片法和孕中期腹部觸診法檢查大鼠受孕情況，以解剖發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)存在仔鼠為受孕成功的標(biāo)準(zhǔn)，比較三種方法檢出大鼠受孕的成功率。結(jié)果? 腹部觸診法判斷大鼠受孕的成功率為100.00%，陰道涂片法為90.00%，陰栓檢查法為40.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 孕中期腹部觸診法對(duì)確定大鼠受孕成功的準(zhǔn)確率最高，但是需結(jié)合確定大鼠交配成功準(zhǔn)確率較高的陰道涂片法共同判斷。

關(guān)鍵詞：陰栓;陰道涂片;腹部觸診;SD大鼠

中圖分類號(hào)：Q492.6? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.16.017

文章編號(hào)：1006-1959（2019）16-0055-03

Abstract：Objective? To compare the accuracy of pregnancy in SD rats by comparing the method of vaginal suppository examination， vaginal smear and mid-abdominal palpation， and provide reference for the efficient construction of SD pregnant mice.Methods? From January to March 2018， 50 female SPF SD rats and 9 SPF male Sprague-Dawley rats were randomly divided into two groups. The rats were randomly mated with vaginal smear， vaginal smear and mid-pregnancy. The palpation method was used to check the pregnancy condition of the rats. The sputum was found to be the standard for successful pregnancy in the uterus. The success rate of the conception of the rats was compared by three methods.Results? The palpation rate of the abdomen palpation method was 100.00%， the vaginal smear method was 90.00%， and the vaginal suppository method was 40.00%，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion? The palpation method in the second trimester of pregnancy has the highest accuracy in determining the success of pregnancy in rats， but it needs to be judged together with the vaginal smear method that determines the high accuracy of mating success.

Key words：Vaginal plug;Vaginal smear;Abdominal palpation;SD rat

大鼠體型較小，與人類遺傳學(xué)較為一致，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件反應(yīng)較為相似，常被譽(yù)為精密的生物研究工具。其妊娠期為19～23 d，平均21 d[1]，排卵通常在發(fā)情后8～10 h，發(fā)情多在夜間[2]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，因?qū)嶒?yàn)要求，常會(huì)用到孕鼠模型。目前對(duì)大鼠是否受孕的判斷使用較多的主要有外部體型直接觀察法、外陰及陰道分泌物觀察法、陰栓檢查法、陰道涂片法等。大鼠合籠交配后，雌鼠的陰道口形成一種特殊的膣栓即陰栓。陰栓是雄鼠的精液、雌鼠的陰道分泌物與陰道上皮細(xì)胞的混合物遇空氣后迅速變硬形成的。但陰栓脫落較早，使用陰栓檢查法判斷大鼠受孕漏檢率較高，目前多使用陰道涂片法，顯微鏡下看到精子即為交配成功。但看到陰栓和（或）精子只證明交配成功，不能證明已受孕，因存在假孕可能。為比較不同方法判斷大鼠受孕成功的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)分別采用陰栓檢查法、陰道涂片法和孕中期腹部觸診法對(duì)大鼠受孕進(jìn)行判斷，旨在為確定大鼠受孕提供更為準(zhǔn)確、高效的辦法。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料? 本實(shí)驗(yàn)方案已通過昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查委員會(huì)審查同意，審批許可號(hào)為KMMU2018032。①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：于2018年1月～3月選取50只未生育過的2～3月齡雌性SPF級(jí)SD大鼠，體重230～300 g，9只SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重280～300 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（湘）2016-0002]。 ②條件：室內(nèi)溫度21～25℃，相對(duì)濕度50%～60%，明暗周期為12 h/12 h，分籠飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)期間自由飲用自來水，食用標(biāo)準(zhǔn)普通柱狀飼料。動(dòng)物飼養(yǎng)設(shè)施條件為屏障設(shè)施環(huán)境[SCXK（滇）K2015-0002]。③器材與試劑：OLYMPUS CH30 型光學(xué)顯微鏡（日本，北京城夕科技有限公司）、潔凈磨砂玻片（泰州市思齊教學(xué)儀器有限公司）、消毒棉簽（河南飄安集團(tuán)有限公司）、生理鹽水。

1.2方法? 將50只SD雌鼠隨機(jī)編號(hào)，于每日17∶00合籠，合籠雌鼠與雄鼠（個(gè)數(shù)比為雌∶雄=3∶1）共同置于未放墊料的潔凈籠具內(nèi)。第2天8∶00，取出雄鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)，休養(yǎng)后繼續(xù)進(jìn)行下一輪合籠。

1.2.1陰栓觀察法? 將待檢查的雌鼠置于操作臺(tái)上（避免尚未檢查的雌鼠受其影響），輕柔安撫雌鼠，拇指和食指捏住其尾巴，其余三指輕壓其后腰背部（此固定方法對(duì)于活躍的大鼠更為適合[3]）。翻起尾巴露出外陰，清理糞便后用生理鹽水潤(rùn)濕的無(wú)菌棉簽輕觸陰道口，如發(fā)現(xiàn)有乳白或淡黃色固態(tài)栓狀物即為陰栓，有陰栓者即交配成功，記為妊娠第“0”天。

1.2.2陰道涂片法? 合籠雌鼠行陰栓檢查后，如未發(fā)現(xiàn)陰栓則繼續(xù)行陰道涂片檢查。將用生理鹽水潤(rùn)濕的無(wú)菌棉簽輕插入雌鼠陰道，在陰道口稍作停留以便雌鼠適應(yīng)，然后繼續(xù)輕輕進(jìn)入陰道約1.5 cm，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)2圈后輕柔拔出棉簽，將棉簽上的附著物均勻涂在載玻片上鏡檢（10×10）。若看到細(xì)長(zhǎng)形、略有彎曲、頭端稍膨大的精子即交配成功，記為妊娠第“0”天。

1.2.3孕中期腹部觸診法? 看到陰栓和（或）精子的雌鼠停止合籠，單獨(dú)喂養(yǎng)，其余繼續(xù)合籠直至觀察到陰栓和（或）精子。交配成功的雌鼠于妊娠第14天進(jìn)行孕中期腹部觸診。孕中期在雙側(cè)腹部觸及多個(gè)花生米大小、質(zhì)韌、可推動(dòng)、成串珠狀排列的組織團(tuán)塊即為胚胎，為受孕成功的標(biāo)志。

1.2.4解剖檢查? 將所有確定為交配成功的雌鼠于妊娠第20天進(jìn)行解剖，檢查雙側(cè)子宮，如有胎鼠存在，證實(shí)受孕成功，否則為受孕失敗。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料采用（%）表示，進(jìn)行？字2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠受孕情況? 在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，50只SD大鼠中共有40只SD雌鼠受孕成功，另有6只證實(shí)交配成功但經(jīng)腹部觸診及解剖證實(shí)并未受孕，而4只SD大鼠交配及受孕均未成功，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)這4只大鼠雙側(cè)子宮內(nèi)存在透亮積液，可能因此導(dǎo)致無(wú)法正常受孕。

2.2三種方法檢出情況? 陰栓檢查法、陰道涂片法、腹部觸診法確定交配成功孕鼠數(shù)、解剖時(shí)見胎鼠孕鼠數(shù)、錯(cuò)檢受孕鼠數(shù)、未檢出受孕鼠數(shù)等各項(xiàng)指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3陰道涂片檢查情況? 涂片時(shí)見多量（近全視野）角化上皮細(xì)胞，當(dāng)晚合籠后次日大多可見精子，可單獨(dú)出現(xiàn)，也可伴隨多量上皮細(xì)胞出現(xiàn)，見圖1。

2.4三種方法的檢出率、假陽(yáng)性率、假陰性率比較? 腹部觸診法檢查大鼠受孕成功的檢出率最高，為100.00%（40/40），其次是陰道涂片法，檢出率為90.00%（36/40），陰栓檢查法檢出率最低，為40.00%（16/40）;三種方法假陽(yáng)性率比較，腹部觸診法最低，為0（0/40），陰栓檢查法為7.50%（3/40），陰道涂片法最高，為15.00%（6/40）;腹部觸診法檢查的假陰性率最低，為0（0/40），陰栓檢查法最高，為60.00%（24/40），陰道涂片法為10.00%（4/40）。

3討論

在婦產(chǎn)科學(xué)、生殖醫(yī)學(xué)及相關(guān)醫(yī)學(xué)研究中，如何高效構(gòu)建孕鼠模型是確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵因素之一。目前，比較常用到的判斷大鼠受孕的方法主要有四種：外部體型直接觀察法、外陰及陰道分泌物觀察法、陰栓檢查法、陰道涂片法。但因?qū)嶒?yàn)環(huán)境和飼養(yǎng)條件不同，不同大鼠受孕后外部體型可能各有不同，且受不同實(shí)驗(yàn)者主觀性影響，外部體型直接觀察法、外陰及陰道分泌物觀察法對(duì)判斷大鼠是否受孕準(zhǔn)確性不高。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)其中的陰栓檢查法、陰道涂片法以及實(shí)驗(yàn)中觀察分析得到的腹部觸診法做出研究。

大鼠性周期為4～5 d，典型的4 d性周期分為發(fā)情前期、發(fā)情期、發(fā)情后期和間情期。大鼠排卵通常在發(fā)情后8～10 h，發(fā)情多在夜間。劉曉宇等[4]研究顯示，大鼠陰部外觀及陰道分泌物與動(dòng)情周期有一定關(guān)系。在做陰道涂片的同時(shí)觀察陰部外觀及陰道分泌物的性質(zhì)。隨著周期的變化，陰部可見紅腫充血，陰道分泌物時(shí)而干燥，時(shí)而呈拉絲狀。但與涂片對(duì)比，外陰及陰道分泌物觀察法不具有特異性，不宜采用此法進(jìn)行大鼠受孕的判斷。發(fā)現(xiàn)陰栓和（或）精子是確定大鼠交配成功的標(biāo)志，并不能保證受孕成功。因此，找到一種判斷大鼠受孕成功準(zhǔn)確性相對(duì)較高的方法非常重要。

陰栓一般在交配后12～24 h自動(dòng)脫落[2]。本實(shí)驗(yàn)過程中陰栓檢查法判斷大鼠受孕成功的檢出率最低，原因可能與無(wú)法準(zhǔn)確了解大鼠交配時(shí)間且陰栓易脫落有關(guān)。陰栓檢查雖然直觀可信，但實(shí)際上陰栓有無(wú)的判定往往很困難，觀察的時(shí)間過早，可能還沒有形成栓，觀察的時(shí)間過晚，陰栓可能已經(jīng)液化或者脫落[5]，也可能被雌鼠清除[6]。因此，單純通過檢查陰栓確定大鼠受孕成功的結(jié)論缺乏嚴(yán)謹(jǐn)性。

陰道涂片法對(duì)于孕早期判斷大鼠受孕具有重要意義，受孕大鼠中多數(shù)在涂片中可發(fā)現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)形、略有彎曲、頭端稍膨大的精子，但是假陽(yáng)性率較高，說明看到精子存在只能證實(shí)交配成功，并不能證實(shí)受孕成功。原因可能是雌鼠在交配時(shí)并非處于動(dòng)情期，由強(qiáng)壯的雄鼠強(qiáng)迫與其受孕，因此未能排卵，精卵結(jié)合不成功導(dǎo)致受孕失敗[7]，也可因環(huán)境等因素導(dǎo)致[8]。另外，動(dòng)物的繁殖高峰期為春季，本實(shí)驗(yàn)于夏季進(jìn)行，且與其他實(shí)驗(yàn)所用大鼠共同飼養(yǎng)于動(dòng)物房，季節(jié)變化及同類影響因素均需予以考慮。降低假陽(yáng)性率的方法可采用孕中期腹部觸診法，一般于磁鼠妊娠第14天進(jìn)行檢查，若早于此時(shí)期，因胚胎較小及母鼠可能出現(xiàn)的子宮積液的干擾，無(wú)法直觀準(zhǔn)確判斷是否受孕成功;若晚于此時(shí)期，有些未成功受孕的大鼠則無(wú)法提前篩選出，造成實(shí)驗(yàn)周期的延長(zhǎng)。孕中期觸診可觸及仔鼠大小及輪廓，判斷準(zhǔn)確率極高，假陰及假陽(yáng)性率皆為三種方法中最低。

在本次實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)陰道涂片發(fā)現(xiàn)，若將當(dāng)天涂片中為多量（近全視野）角化上皮細(xì)胞的雌鼠當(dāng)晚合籠，次日涂片多可見精子，精子可單獨(dú)出現(xiàn)，也可伴隨多量角化上皮細(xì)胞出現(xiàn)。由此可見，多量上皮細(xì)胞是雌鼠發(fā)情的特異性標(biāo)志，此時(shí)合籠可提高受孕率。多量上皮細(xì)胞的出現(xiàn)天數(shù)是否與發(fā)情天數(shù)準(zhǔn)確相符，可進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，陰道涂片法和孕中期腹部觸診法聯(lián)合應(yīng)用于孕中期即可證實(shí)雌鼠是否受孕，具有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)，可有效提高孕鼠檢出率及降低假陽(yáng)性受孕的發(fā)生率，對(duì)于構(gòu)建孕鼠模型具有重要意義。

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收稿日期：2019-5-20;修回日期：2019-5-30

編輯/成森