胡 雷，李永念，祝麗麗，羅昭遜

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州貴陽 550003；2.貴州醫(yī)科大學(xué)兒科學(xué)院，貴州貴陽 550004)

膿毒癥是由重度感染引起的臨床綜合征，常伴有多種器官功能受損，具有較高的病死率。健康者的免疫和生理反應(yīng)可以有效地殺傷病原體，這些功能的失調(diào)會導(dǎo)致膿毒癥的發(fā)生，而持續(xù)的中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞的活化會加速這個過程。另外，淋巴細(xì)胞共刺激分子的表達(dá)增多、淋巴細(xì)胞凋亡的加速、中性粒細(xì)胞凋亡的延遲以及組織細(xì)胞壞死的增強均是膿毒癥形成的重要機制[1]。單核細(xì)胞協(xié)同其他吞噬細(xì)胞(包括中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞)共同構(gòu)成人體的固有免疫系統(tǒng)，它們是機體對抗病原體的第一道防線[2-3]。機體受到寄生蟲或者細(xì)菌感染時，特別是在經(jīng)典的Ⅰ型炎癥環(huán)境中，在促炎癥因子干擾素(IFN)和腫瘤壞死因子(TNF)等的刺激下，骨髓中的單核細(xì)胞會進(jìn)入血液或者其他組織中，分化為經(jīng)典活化M1型巨噬細(xì)胞，并且常高表達(dá)一氧化碳合酶(iNOS)[4]。而在Ⅱ型炎癥環(huán)境中(如線蟲感染或手術(shù)后)，在炎癥因子IL-4 、IL-13等的刺激下，組織原位的巨噬細(xì)胞不依賴骨髓來源的單核細(xì)胞而自行增殖分化為選擇性活化的M2型巨噬細(xì)胞，這類細(xì)胞高表達(dá)精氨酸酶1[5-6]。外泌體是細(xì)胞分泌的囊狀微泡，其內(nèi)包裹大量蛋白、脂類、微小RNA、mRNA、DNAs，用于細(xì)胞間信息傳遞和分子轉(zhuǎn)運。外泌體主要通過調(diào)節(jié)抗原提呈、活化或抑制免疫細(xì)胞、影響免疫監(jiān)督和細(xì)胞間通訊等方式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能[7-9]。而外泌體在膿毒癥形成過程中的作用還鮮有報道，特別是其是否影響單核巨噬細(xì)胞的極化而發(fā)揮其免疫調(diào)控作用還不清楚。本研究通過收集膿毒癥患者血液中的外泌體，并用其刺激人單核細(xì)胞系的U937細(xì)胞，觀察其是否影響細(xì)胞的極化，旨在闡明外泌體在膿毒癥形成過程中的作用提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2016年1月至2017年12月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院ICU收治的膿毒癥患者23例納入研究，男16例、女7例，抽取每位患者血液5 mL用于外泌體的提取。患者均知情同意并簽署知情同意書。上述患者均有明顯高熱和顯著的白細(xì)胞、炎性反應(yīng)指標(biāo)升高，均有致病菌感染，均符合膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡≥ 18歲；(2)體溫>38 ℃或<36 ℃ ；(3)心率>90 次/分 ；(4)患者呼吸頻率>20 次/分；(5)WBC>12×109/L或<4×109/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有惡性腫瘤或免疫缺陷疾??；(2)伴有慢性腎衰竭；(3)伴有急慢性心功能衰竭；(4)伴有血液系統(tǒng)疾?。?5)入院48 h內(nèi)死亡或者出院的患者。另外，選取23例同期于該院進(jìn)行體檢且年齡匹配的健康體檢者作為對照，用同樣的方法抽取5 mL血液標(biāo)本備用。

1.2儀器與試劑 U937細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司；DMSO、LPS和TRIzol均為Invitrogen公司產(chǎn)品，佛波酯(PMA)為MCE公司產(chǎn)品；細(xì)胞培養(yǎng)采用的RPMI 1640培養(yǎng)基和無外泌體血清均為Gibco公司產(chǎn)品；ReverTra Ace 實時熒光定量PCR(qPCR)反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑均為TOYOB公司產(chǎn)品；重組人白細(xì)胞介素(IL)-4 蛋白、兔抗CD63抗體、兔抗CD9抗體、人IP-10 ELISA 試劑盒 (CXCL10)、人TNF-α ELISA 試劑盒、人 IL-1β ELISA 試劑盒、人腫瘤生長因子(TGF)-β ELISA試劑盒均為Abcam公司產(chǎn)品；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒和SDS-PAGE蛋白凝膠試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司；ECL發(fā)光試劑盒為美國millipore公司生產(chǎn)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司；血清總外泌體提取試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品。低溫離心機為Eppendorf公司5810R型；-80 ℃低溫冰箱為青島海爾公司DW-86L626型；倒置顯微鏡為Nikon公司TS100型；酶標(biāo)儀為Bio-rad公司680型；凝膠成像儀為ChemiScope公司5600型和qPCR儀為Bio-Rad 公司iQ5型。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) U937細(xì)胞用含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，每隔1 d換液，每3 d進(jìn)行一次傳代。用PMA(濃度為100 ng/mL)誘導(dǎo)U937細(xì)胞12 h，使其向巨噬細(xì)胞分化，以加入同體積的DMSO作為對照；在此基礎(chǔ)上分別用LPS(濃度為100 ng/mL)誘導(dǎo)48 h，使其向M1型巨噬細(xì)胞分化，或者用IL-4(濃度為20 ng/mL)誘導(dǎo)48 h，使其向M2型巨噬細(xì)胞分化；并在PMA刺激后分別用健康者人和膿毒癥患者來源的外泌體(濃度為0.1 μg/mL)刺激細(xì)胞48 h。

1.3.2外泌體的提取與鑒定 將收集的血液室溫下靜置30 min，在4 ℃離心機1 200×g離心15 min,分裝于1.5 mL EP管中,儲存于-80 ℃冰箱備用。根據(jù)血清總外泌體提取試劑盒操作步驟提取外泌體，用碧云天BCA蛋白定量試劑盒定量后，一部分用PBS重懸用于刺激細(xì)胞，另一部分用Western blot的方法檢測CD63和 CD9的表達(dá)，一抗稀釋1 000倍，二抗稀釋3 000倍。

1.3.3Real-time PCR 通過TRIzol裂解細(xì)胞，并提取總RNA。用ReverTra Ace qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并按照SYBR green試劑的實驗步驟進(jìn)行PCR反應(yīng)。所有目的基因表達(dá)量以GAPDH的表達(dá)量作為內(nèi)參，所有目的基因的表達(dá)均消除各自內(nèi)參后得到相對循環(huán)閾值(Ct值)，即ΔCt，若要做A與B兩組某種基因表達(dá)的比較，即A是B的2-(ΔCtA-ΔCtB)倍。引物序列如下,CD68正向：5′-AGG CTG TGG GTG GGA TCA-3′，CD68反向:5′- CTT GGA AAG GAG GAA ATG AAA GTC-3′；CXCL10正向:5′-TTC CTG CAA GCC AAT TTT GTC-3′，CXCL10反向:5′-TCT TCT CAC CCT TCT TTT TCA TTG T-3′；TNF-α正向:5′-GCA GGT CTA CTT TGG GAT CAT TG-3′，TNF-α反向:5′-GCG TTT GGG AAG GTT GGA-3′；IL-1β正向:5′-TCA GCC AAT CTT CAT TGC TCA A-3′，IL-1β反向:5′-TGG CGA GCT CAG GTA CTT CTG-3′；CD206正向:5′-CGC TAC TAG GCA ATG CCA ATG-3′，CD206反向:5′-GCA ATC TGC GTA CCA CTT GTT TT-3′；TGF-β正向:5′-CGC GTG CTA ATG GTG GAA A-3′，TGF-β反向:5′-GCT GTG TGT ACT CTG CTT GAA CTT GT-3′；GAPDH正向:5′ -CTT AGC ACC CCT GGC CAA G-3′，GAPDH反向:5′ -GAT TCT GGA GAG CCC CG-3′。

1.3.4ELISA U937細(xì)胞經(jīng)PMA誘導(dǎo)12 h后，再分別進(jìn)行IL-4、LPS、健康者血清外泌體和膿毒癥患者外泌體刺激48 h，收集培養(yǎng)上清，按照Abcam公司ELISA檢測試劑盒說明書實驗步驟檢測 CXCL10、TNF-α、IL-1β和 TGF-β的水平。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 用統(tǒng)計分析軟件SPSS17.0進(jìn)行處理，多組間實驗數(shù)據(jù)的比較使用單因素方差分析，兩組間的比較用SNK-q檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PMA誘導(dǎo)U937細(xì)胞向巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分化 U937細(xì)胞是懸浮細(xì)胞，經(jīng)PMA誘導(dǎo)后，大量細(xì)胞黏附在培養(yǎng)板底，并有一些細(xì)胞長出小的突起，見圖1A，且PMA誘導(dǎo)促使巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子CD68的mRNA表達(dá)明顯增加，見圖1B，表明PMA可誘導(dǎo)U937細(xì)胞向巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分化。

2.2外泌體的鑒定 從健康者與膿毒癥患者血清提取的外泌體，經(jīng)PBS重懸后BCA法進(jìn)行蛋白定量，取10 μg總蛋白，提取的外泌體均明顯表達(dá)CD63和CD9這兩個外泌體的分子標(biāo)記，見圖2。

2.3膿毒癥患者來源外泌體對U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 LPS促使U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞有更多的突起生成，IL-4對U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)無明顯影響，膿毒癥患者來源外泌體也明顯地促使U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的突起生成，這與LPS誘導(dǎo)后的細(xì)胞形態(tài)相似，而健康者血清來源的外泌體無這種功能，見圖3。這表明膿毒癥患者來源的外泌體具有M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)劑相似的功能。

圖1 PMA誘導(dǎo)U937細(xì)胞向巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分化(×200)

圖2 健康者人和膿毒癥患者血清來源的外泌體表達(dá)CD63和CD9

圖3 不同因素刺激下U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

注：*表示P<0.05圖4 膿毒癥患者來源的外泌體促使U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中CXCL10、TNF-α、IL-1β的轉(zhuǎn)錄

2.4膿毒癥患者來源外泌體促進(jìn)U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的轉(zhuǎn)錄 qPCR 檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子(CXCL10、TNF-α、IL-1β)和 M2型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子(CD206、TGF-β)在mRNA水平的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，LPS促使巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的表達(dá)增加，IL-4促使巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞CD206、TGF-β的表達(dá)增加，膿毒癥患者來源的外泌體也明顯地促使CXCL10、TNF-α、IL-1β表達(dá)的增加，這與LPS的效應(yīng)相似，而健康者血清來源的外泌體無這種功能。見圖4。

2.5膿毒癥患者來源外泌體促進(jìn)U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分泌CXCL10、TNF-α、IL-1β LPS使巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌增加，IL-4使巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞TGF-β的分泌增加，膿毒癥患者來源的外泌體也促進(jìn)了CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌，這與LPS有相似的功能，而健康者來源的外泌體無這種功能。這表明膿毒癥患者來源的外泌體可促使巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞向M1型極化。見圖5。

注：*表示P<0.05圖5 膿毒癥患者來源的外泌體促使U937-巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞中CXCL10、TNF-α、IL-1β的分泌

3 討 論

膿毒癥目前仍是重癥醫(yī)學(xué)領(lǐng)域面臨的重大難題，每年都有大量患者因此死亡[10]。有研究針對全球37個國家超過11 000名膿毒癥患者的資料進(jìn)行匯總，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有57%的患者是革蘭陰性菌感染，有44%的患者是革蘭陽性菌感染，11%的患者是真菌感染[11]?？梢姡摱景Y往往是由病原體感染引起的，這些病原體感染后引發(fā)的免疫應(yīng)答可能是導(dǎo)致多種臨床癥狀的主要原因，抑制病原體和減弱由病原體感染誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是緩解膿毒癥的重要手段。

巨噬細(xì)胞因其功能狀態(tài)不同，可分為M1和M2型。M1型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CXCL10、TNF-α和IL-1β(可作為M1型巨噬細(xì)胞的分子標(biāo)記)[12]。巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌后會產(chǎn)生一系列炎癥因子，進(jìn)而激活固有免疫系統(tǒng)來抵御細(xì)菌的侵襲[1]，此時的巨噬細(xì)胞為M1型。M2型巨噬細(xì)胞具有抗炎功能，表現(xiàn)為高表達(dá)甘露醇受體CD206和TGF-β[13]。IL-4能促進(jìn)巨噬細(xì)胞CD206的表達(dá)增加[14-15]。在疾病發(fā)生過程中，巨噬細(xì)胞的極化程度取決于其所處的組織微環(huán)境[16]。在膿毒癥的發(fā)生過程中，病原體的持續(xù)存在會過度活化體內(nèi)免疫細(xì)胞，導(dǎo)致免疫應(yīng)答的持續(xù)活躍。巨噬細(xì)胞作為免疫應(yīng)答中的重要一環(huán)，其向M1型轉(zhuǎn)變會加重膿毒癥。

細(xì)胞釋放的外泌體中含有豐富的蛋白、脂類、microRNA和mRNA，通過這些物質(zhì)的轉(zhuǎn)運來發(fā)揮細(xì)胞間信息傳遞的作用，大量研究表明其也具有調(diào)控免疫應(yīng)答的功能[7]。外泌體因其來源的細(xì)胞及所處的微環(huán)境不同而發(fā)揮不同的免疫調(diào)節(jié)作用。細(xì)菌感染的巨噬細(xì)胞來源的外泌體具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，其具有刺激巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞高表達(dá)TNF和iNOS的作用[17]，而且這些外泌體還可增強機體免疫監(jiān)視的功能[18]。另外，CD4+T細(xì)胞來源的外泌體能促進(jìn)T細(xì)胞的活化[19]。成熟樹突細(xì)胞來源的外泌體可通過TNF信號途徑活化免疫反應(yīng)[20]。相對于以上提到的外泌體所具有的促進(jìn)免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的作用來說，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體具有抑制免疫應(yīng)答和炎性反應(yīng)的作用[21]。腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可以有效抑制T細(xì)胞和NK細(xì)胞活性，并活化粒細(xì)胞來源的抑制細(xì)胞來發(fā)揮免疫抑制作用[22-23]。此外，黑色素瘤細(xì)胞外泌體內(nèi)包裹的Fas配體能通過促進(jìn)淋巴細(xì)胞的凋亡來抑制免疫應(yīng)答[24]。而在膿毒癥形成過程中，體內(nèi)的免疫細(xì)胞可能也會受到外泌體的影響而發(fā)生功能狀態(tài)的改變，從而加劇膿毒癥的進(jìn)程。

在本研究中，為了判斷膿毒癥患者來源外泌體對巨噬細(xì)胞功能的影響，本課題組首先用PMA誘導(dǎo)人U937單核細(xì)胞向巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞分化[25]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PMA促使懸浮生長的U937細(xì)胞貼壁生長，并長出小的突起，具有了巨噬細(xì)胞樣的形態(tài)特征，而且巨噬細(xì)胞的標(biāo)記分子CD68也表達(dá)增加。在此基礎(chǔ)上，本課題組采用健康者血清與膿毒癥患者來源的外泌體刺激PMA誘導(dǎo)后的U937細(xì)胞，并以健康者來源外泌體、IL-4或者LPS刺激作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-4誘導(dǎo)的細(xì)胞可有效表達(dá)M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)記分子，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞可高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子，膿毒癥來源的外泌體具有與LPS相似的功能，也促進(jìn)PMA誘導(dǎo)的U937細(xì)胞高表達(dá)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記分子，而健康者血清來源的外泌體卻沒有這種功能。

4 結(jié) 論

膿毒癥來源的外泌體具有促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1型極化的作用，為外泌體在炎癥疾病發(fā)生中的作用增加了實驗依據(jù)，提示外泌體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞向促炎癥表型分化可能是膿毒癥形成的一種病理機制，也為膿毒癥的防治提供了一定的理論基礎(chǔ)。