冶 金，王美皓，敖慧娟，楊 琨，阿依木古麗，喬自林，柏家林*

（1.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心/生物工程與技術國家民委重點實驗室，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 生物醫(yī)學研究中心/甘肅省動物細胞技術創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030）

MDCK細胞系是由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬的腎臟組織中分離培養(yǎng)所建立[1]，其在培養(yǎng)過程中合成緊密連接（tight junction, TJ）蛋白分泌至細胞表面形成單細胞層[2]，呈上皮樣細胞形態(tài)學特征，通常為貼壁培養(yǎng)并且能連續(xù)傳代。隨著國內外大規(guī)模細胞培養(yǎng)技術的不斷成熟和被應用，流感病毒疫苗的制備也逐漸由哺乳動物細胞系取代傳統(tǒng)雞胚為生產基質[3]，其中MDCK細胞由于對不同流感病毒株具有易感染、易培養(yǎng)、增殖快且病毒不易變異等特點[4]，被公認為是最適于流感病毒疫苗生產的重要細胞系之一[5]。

緊密連接是上皮細胞間的一種重要連接方式[6]，主要由TJ蛋白組成，負責調控細胞旁離子和溶質分子的跨膜運輸以及維持細胞極性狀態(tài)[7]，在細胞中最初發(fā)現緊密連接就是由于其可通過細胞旁路途徑控制滲透作用[8]。1986年Steveson[9]首次發(fā)現與細胞緊密連接相關的蛋白ZO-1（zonula occludens-1，閉鎖小帶蛋白1），同時有研究發(fā)現在無緊密連接的非上皮細胞中也存在ZO-1蛋白的表達，與粘附連接直接相連[10]。上皮細胞中的ZO-1蛋白則通過跨膜蛋白連接至細胞骨架處[11]，在TJ蛋白的形成、維持上皮組織正常結構和功能以及調控細胞分化、增殖和遷移等生理活動中發(fā)揮重要作用[12]，與細胞成瘤性有著密切關系。

本文擬通過應用免疫組化及熒光染色檢測MDCK貼壁細胞中ZO-1蛋白表達情況，為研究MDCK貼壁細胞內源性蛋白表達及功能作用提供數據支持，為探究ZO-1蛋白與MDCK細胞的成瘤性作用奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 MDCK貼壁細胞，由西北民族大學生物醫(yī)學研究中心提供。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和PBS（蘭州百靈生物技術有限公司）；新生牛牛血清（蘭州民海生物有限公司）；4%多聚甲醛（武漢博士德生物工程有限公司）；閉鎖小帶蛋白1抗體、SP免疫組化試劑盒、FITC標記的羊抗兔IgG、DAPI染液和免疫熒光抗淬滅封片劑（北京博奧森生物技術有限公司）；增強型DAB顯色試劑盒和Mayer蘇木素染液（大連美侖生物技術有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞爬片制備 將經多聚賴氨酸處理的蓋玻片置于6孔板中，按1×106/ml 的細胞密度將已消化的細胞接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h左右。

1.2.2 SP法免疫組化染色 將細胞爬片從培養(yǎng)板中取出，PBS清洗；滴加4%多聚甲醛室溫固定20 min；滴加0.5%Triton X-100通透20 min；滴加3%H2O2，室溫孵育15 min以消除內源性過氧化物酶活性，然后滴加封閉用正常山羊血清工作液，37℃ 孵育20 min；用吸水紙吸去封閉液；滴加稀釋度為1:100的閉鎖小帶蛋白1抗體，37℃ 孵育2 h；滴加生物素化二抗工作液，37℃ 孵育20 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃ 孵育20 min；顯色液DAB顯色，蘇木素復染后在顯微鏡下觀察并進行封片。

1.2.3 免疫熒光染色 將細胞爬片從培養(yǎng)板中取出，PBS清洗；滴加4%多聚甲醛室溫固定20 min；滴加0.5%Triton X-100通透20 min；滴加3%H2O2，室溫孵育15 min以消除內源性過氧化物酶活性，然后滴加封閉用正常山羊血清工作液，孵育20 min；用吸水紙吸去封閉液；滴加稀釋度為1:100的閉鎖小帶蛋白1抗體，37℃ 孵育2 h；滴加稀釋度為1:100的FITC標記的羊抗兔IgG 熒光二抗于37℃ 避光孵育1 h；滴加DAPI染液室溫孵育5 min，PBS清洗（×4）；用吸水紙吸去細胞爬片上的液體，使用免疫熒光抗淬滅封片劑封片后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2 結果

2.1 SP免疫組化法檢測ZO-1蛋白在MDCK貼壁細胞中的表達

實驗陰性對照使用PBS為一抗對MDCK貼壁細胞進行免疫組化染色，結果顯示ZO-1蛋白主要在胞核及胞漿中表達，呈棕褐色、淺褐色顆粒。通過免疫組化圖可以觀察出，ZO-1蛋白在胞核中表達較多，顏色較深，在胞漿中表達較少，顏色較淺，詳見圖1。

圖1 免疫組化染色結果

2.2 免疫熒光染色檢測ZO-1蛋白在MDCK貼壁細胞中的表達

為確認免疫組化染色結果的準確性，采用免疫熒光染色檢測ZO-1蛋白在MDCK貼壁細胞中的表達情況。經DAPI染色后在顯微鏡下可觀察到藍色熒光的細胞，正常細胞核核形完整，染色質均勻，非正常細胞核破裂成碎片，染色質固縮，向外周聚集成周邊化。與ZO-1蛋白Ⅰ抗和帶有FITC特異標記的Ⅱ抗結合后，含有ZO-1蛋白的細胞會發(fā)綠色熒光為陽性，無ZO-1蛋白的無綠色熒光為陰性。在細胞核中可見強度較強的綠色熒光，胞漿中也有綠色熒光出現，但強度不強。結果表明ZO-1蛋白在MDCK貼壁細胞中胞核表達高于胞漿表達。

圖2 免疫熒光染色結果

3 討論

ZO-1不僅構成細胞間緊密連接，而且間接參與細胞骨架形成，已有研究證明ZO-1與腫瘤細胞的初發(fā)及擴散存在密切聯系[13]，其表達異?？梢鹁o密連接結構與功能異常并導致腫瘤細胞侵襲轉移。本研究發(fā)現MDCK貼壁細胞正常培養(yǎng)狀態(tài)下，胞核ZO-1蛋白表達強，可能說明ZO-1蛋白在其細胞致瘤性方面發(fā)揮作用。Balda等發(fā)現ZO-1與腫瘤分化程度相關，可能是由于細胞連接中ZO-1蛋白的減少，導致腫瘤細胞擴散能力的增強[14]；Tada等發(fā)現在大鼠腦動脈瘤的發(fā)生中觀察到了ZO-1蛋白的表達減少，并認為其與內皮細胞損傷和巨噬細胞的遷移有關[15]。

MDCK細胞作為生產流感病毒疫苗的最適細胞系，成瘤性強弱亦是影響其生物制品質量關鍵，已確定ZO-1蛋白在MDCK貼壁細胞中表達，但ZO-1是否影響MDCK細胞成瘤還需進一步研究。