趙凌舟，邢 巖，劉長存，郭李磊，喬文禮，趙晉華

上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院核醫(yī)學科，上海 200080

肺癌是我國發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占其80%以上［1］。目前NSCLC的治療手段主要包括手術(shù)、放化療和分子靶向治療，患者的平均生存期和5年生存率均很低［2］。近些年，通過增強機體抗腫瘤免疫力而抑制和殺傷腫瘤細胞的腫瘤免疫治療日益受到重視，其中程序性死亡受體1（programmed cell death protein 1，PD-1）和程序性死亡受體-配體1（programmed cell death-ligand 1，PD-L1）抑制劑是常用的腫瘤免疫治療方法之一［3-6］。目前已批準上市的6種PD-1/PD-L1抗體藥物，有4種可用于NSCLC的治療［7-9］。PD-1/PD-L1抗體免疫治療效果與腫瘤PD-L1高表達密切相關(guān)。穿刺活檢是目前確定腫瘤組織PD-L1表達的情況主要方法，但只能代表小區(qū)域PD-L1表達狀態(tài)，無法反映整個腫瘤組織和轉(zhuǎn)移病灶的情況，因此需要發(fā)展能夠準確檢測PD-L1表達的影像學技術(shù)。本課題組前期已獲得高親和力結(jié)合PD-L1的納米抗體，可有效識別不同PD-L1表達水平的NSCLC細胞。在此基礎(chǔ)上，本研究進一步進行99mTc標記，開展PD-L1表達的可視化研究，通過建立不同PD-L1表達水平的NSCLC移植瘤模型，評價制備的顯像劑顯示腫瘤PD-L1表達的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

PD-L1納米抗體和三羰基化合物試劑盒由蘇州納洛邁生物科技有限公司提供；Na99mTcO4購自上海原子科興藥業(yè)有限公司；HCC827和A549 NSCLC細胞、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基、胰酶、HEPES緩沖液和磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）及其他試劑購自上海迪奧生物科技有限公司；4～6周齡BALB/c裸小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司；快速薄層色譜硅膠紙（ITLC-SG）和TLC硅膠鋁板購自北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；放射性薄層液相色譜儀（Radio-TLC）購自美國BioScan公司；Endosafe-PTS及配套耗材購自北京恒益德科技有限公司；高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）購自日本W(wǎng)aters公司，配套γ檢測器；小動物SPECT/CT顯像于蘇州大學分子影像與核醫(yī)學研究中心完成，儀器購自荷蘭MILabs公司；Biacore 8K高通量生物大分子分析儀購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.199mTc(CO)3(H2O)3的制備和質(zhì)控

胰島素注射器抽取1 mL高锝酸鈉（1.8×109Bq左右），注入三羰基化合物小瓶中，瓶中粉末充分溶解后水溶（98℃），反應(yīng)30 min后取出小瓶，冷卻至室溫，隨后加入HCl溶液（1 mol/L）調(diào)節(jié)pH值至7.4左右。分別以pH=5.4的檸檬酸緩沖液為展開劑和ITLC-SG為固定相，以1%氯化氫甲醇溶液為展開劑和TLC硅膠鋁板為固定相，于層析缸中展開，測量標記產(chǎn)物的放射化學純度。標記率大于95%時，即制備成功，放置備用。

1.2.299mTc-PD-L1納米抗體的制備

PD-L1納米抗體制備過程大致步驟如下：單峰駱駝注射PD-L1抗原，免疫系統(tǒng)表達一系列特異性PD-L1抗體，收集血液，分離淋巴細胞，提取mRNA，然后體外轉(zhuǎn)錄、翻譯和篩選，得到能夠特異性結(jié)合PD-L1的納米抗體。取含有200 μg PD-L1納米抗體的PBS（100 μL），與上述制備的99mTc(CO)3(H2O)3混合于2 mL小瓶中，隨后水?。?7℃），反應(yīng)60 min后取出小瓶，以pH=5.4的檸檬酸緩沖液為展開劑和ITLC-SG為固定相展開，測量標記產(chǎn)物的放射化學純度。

1.2.399mTc-PD-L1納米抗體體外穩(wěn)定性評價

分別取少量99mTc-PD-L1納米抗體（200 μL）與1.8 mL PBS 和血清混合水?。?7℃）。1、2和3 h后，用HPLC計算放射化學純度，評價體外穩(wěn)定性。HPLC條件為：含1%三氟乙酸的45%乙腈水溶液為流動相，分子篩柱（300 ?，5 μm，250 mm×4.6 mm），檢測波長為254 nm，流速1 mL/min。

1.2.4 體外親和力測定

采用表面等離子體共振法測定PD-L1納米抗體與人PD-L1蛋白的結(jié)合親和力。所有測量均在Biacore 8K儀器上進行，使用HEPES緩沖液作為流動相。首先配置5個不同濃度（1.24×10-8、6.19×10-9、3.09×10-9、7.73×10-10和3.87×10-10mol/L）的PD-L1納米抗體溶液，隨后以30 μL/min在含有PD-L1密度高蛋白質(zhì)CM5傳感器芯片上展開，并記錄信號強度；PD-L1納米抗體能夠與靶蛋白結(jié)合和解離，監(jiān)測解離720 s，最后利用Biacore評價軟件將所得的數(shù)據(jù)與理論曲線擬合，計算平衡解離常數(shù)KD值。

1.2.5 細胞培養(yǎng)

配制含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液。從液氮罐中取出HCC827和A549細胞凍存管，于37℃水浴箱中快速復(fù)溫解凍，在超凈工作臺將解凍的細胞懸液吸入離心管中離心（1 000 r/min，3 min），棄上清液，加入RPMI-1640培養(yǎng)液重懸并移入培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。隔天換液，待HCC827和A549細胞生長融合成單層時，PBS浸洗3遍，用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸消化并傳代。

1.2.6 建立NSCLC裸小鼠移植模型

4～6周齡BALB/c裸小鼠隨機分為2組，每組4只，分別于前肢皮下注射HCC827和A549細胞（5×106，100 μL），在標準動物飼養(yǎng)房中飼養(yǎng)，待腫瘤直徑達到0.8 cm左右時用于顯像。

1.2.7 細菌內(nèi)毒素測定

啟動Endsafe-PTS細菌內(nèi)毒素快速檢測儀，按照操作界面提示插入卡片和輸入相關(guān)信息，然后在卡片上4個進樣孔滴加25 μL標志物，進行細菌內(nèi)毒素測定。

1.2.8 SPECT/CT顯像

將裸小鼠麻醉后，尾靜脈注射99mTc-PD-L1納米抗體（3.7×107Bq，100 μL）后，分別于30、90 min進行小動物SPECT/CT顯像。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 99mTc-PD-L1納米抗體的制備、純化、穩(wěn)定性試驗和細菌內(nèi)毒素測定

本研究獲得的納米抗體，相對分子質(zhì)量約為15 000，純度大于99%，與人PD-L1蛋白具有高親和力，KD值約為1.5×10-9mol/L（圖1）。隨后，利用三羰基化合物試劑盒制備標記前體三羰基锝化合物99mTc(CO)3(H2O)3，然后制備99mTc-PD-L1納米抗體。結(jié)果顯示，三羰基化合物試劑盒可成功制備99mTc(CO)3(H2O)3化合物，以pH=5.4的檸檬酸緩沖液為展開劑和ITLC-SG為固定相，99mTc(CO)3(H2O)3位于ITLC-SG前沿（Rf=1.0），锝膠體位于ITLC-SG原點（Rf=0），以1%氯化氫甲醇溶液為展開劑和TLC硅膠鋁板為固定相，99mTc(CO)3(H2O)3位于ITLC-SG原點（Rf=0），未反應(yīng)Na99mTcO4位于ITLC-SG前沿（Rf=1.0），計算后標記率為（97.0±2.4）%（n=3）；在制備99mTc(CO)3(H2O)3過程中，產(chǎn)生的锝膠體和未反應(yīng)Na99mTcO4很少，無需進一步純化；隨后99mTc(CO)3(H2O)3溶液與PD-L1納米抗體溶液混合，水浴反應(yīng)60 min，以pH=5.4的檸檬酸緩沖液為展開劑和ITLC-SG為固定相，99mTc-PD-L1納米抗體位于原點（Rf=0），99mTc(CO)3(H2O)3位于ITLC-SG前沿（Rf=1.0），計算后標記率為（98.0±1.3）%（n=3）。制備的99mTc-PD-L1納米抗體為PBS，pH在7.4左右，體外穩(wěn)定性實驗表明99mTc-PD-L1納米抗體在PBS和血清中3 h內(nèi)放射化學純度均大于95%，具有良好的體外穩(wěn)定性（圖2）。細菌內(nèi)毒素測定結(jié)果顯示其含量均小于15 EU/mL，符合要求。

圖 1 PD-L1納米抗體與人PD-L1蛋白的結(jié)合親和力測定

圖 2 99mTc-PD-L1納米抗體在PBS和血清中不同時間點的HPLC譜圖

2.2 NSCLC移植瘤裸小鼠99mTc-PD-L1納米抗體的SPECT/CT顯像

NSCLC移植瘤裸小鼠的SPECT/CT圖像（圖3）顯示：99mTc-PD-L1納米抗體主要濃聚在腎臟和膀胱，顯像劑主要通過泌尿系統(tǒng)排泄。整個顯像期間，肝臟、脾臟、心臟、肺及軟組織等顯影微弱，甲狀腺區(qū)未見放射性攝取。在PD-L1高表達組，注射顯像劑30 min后即有顯影，隨后腫瘤攝取持續(xù)增加，周圍組織放射性減弱，90 min時腫瘤顯像清楚；而PD-L1陰性組在顯像期間，腫瘤部位未見明顯的放射性攝取，表明99mTc-PD-L1納米抗體能夠顯示腫瘤PD-L1的表達情況，提示99mTc-PD-L1納米抗體在體內(nèi)具有良好的特異性。利用小動物SPECT/CT自帶的軟件進行分析，勾畫出心、肺、肝、腫瘤和肌肉為感興趣區(qū)，采用半定量的方法評價30 min時99mTC-PD-L1納米抗體生物分布（圖4），考慮到腎臟的放射性強度過高，未進行分析。結(jié)果顯示，PD-L1高表達組與PD-L1陰性組在心臟、肺、肝臟和肌肉部位的放射性攝取無顯著差異；而在腫瘤組織中，PD-L1高表達組顯著高于PD-L1陰性組（約為后者的6倍），并且PD-L1陰性組的腫瘤攝取與肌肉接近。

圖 3 皮下腫瘤裸鼠注射99mTc-PD-L1納米抗體后（n=4）30和90 min時PD-L1高表達組和陰性組的SPECT/CT圖像

圖 4 99mTc-PD-L1納米抗體在PD-L1高表達組（HCC827）和PD-L1陰性組（A549）30 min時的生物分布

3 討 論

臨床試驗發(fā)現(xiàn)，NSCLC中PD-L1表達增加與PD-1/PD-L1抗體治療的獲益關(guān)系密切［10-12］。Rizvi等［11］以PD-L1表達率5%為陽性組臨界值，將NSCLC患者分成PD-L1陽性組和PD-L1陰性組，給予PD-1抗體藥物Nivolumab治療，結(jié)果顯示PD-L1陽性組的客觀緩解率為50%，而PD-L1陰性組未觀察到治療反應(yīng)，中位無進展生存期分別為45.6周和 36.1周，表明PD-L1表達水平與免疫治療的有效率和預(yù)后相關(guān)。Gandhi等［12］以PD-L1表達率50%為陽性組臨界值，NSCLC患者經(jīng)過PD-1抗體藥物Pembrolizumab治療6個月后，PD-L1陽性組和PD-L1陰性組的客觀緩解率分別為67%和0%，中位無進展生存期率為67%和11%，總生存率為89%和33%，提示PD-L1表達狀態(tài)可作為一個免疫治療的療效預(yù)測指標用于篩選免疫治療優(yōu)勢人群。國內(nèi)臨床研究也報道了類似的結(jié)論，Chen等［13］的研究提示NSCLC患者的原位腫瘤細胞和腫瘤相關(guān)巨噬細胞的PD-L1表達率均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。馬薇等［14］發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的腫瘤細胞及腫瘤間質(zhì)淋巴細胞和巨噬細胞的PD-L1表達水平與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后生存密切相關(guān)。因此，隨著PD-1/PD-L1抗體治療NSCLC的快速發(fā)展，有關(guān)PD-L1表達在NSCLC中篩選免疫治療優(yōu)勢人群、指導(dǎo)診斷及評價療效的臨床需求也日益增加。

穿刺活檢是當前臨床上檢測PD-L1表達的主要方法，但將此方法得到的PD-L1表達水平結(jié)果作為PD-1/PD-L1抗體治療的啟用標準仍存在一些難題：① 不同PD-1/PD-L1抗體治療采用的檢測方法不同，可能會產(chǎn)生不一致的結(jié)果；② 不同的臨床試驗使用不同的PD-L1陽性閾值（范圍：1%～50%），可能會導(dǎo)致評估緩解或生存情況的結(jié)論存在差異。此外，該方法還存在多種技術(shù)性問題：① 腫瘤組織穿刺活檢有損傷性，不宜多次進行；② 一般只針對原位腫瘤組織，難以對轉(zhuǎn)移病灶取樣；③ 腫瘤組織中PD-L1的表達具有異質(zhì)性，不同部位PD-L1的表達存在差異，且PD-L1表達會隨時間和治療情況發(fā)生動態(tài)變化，而活檢組織染色只能代表小區(qū)域PD-L1的表達狀態(tài)，無法完整、準確地反映整個腫瘤組織和轉(zhuǎn)移病灶的情況，可能造成假陰性。這或許可解釋為什么一些PD-L1表達量較高的NSCLC患者臨床治療反應(yīng)不顯著，而PD-L1低表達甚至陰性的患者卻能獲得良好的PD-1/PD-L1治療反應(yīng)。因此，臨床需要一種新方法，準確、全面、安全地反映腫瘤PD-L1的表達和分布情況，以彌補當前穿刺活檢技術(shù)的缺陷。

核醫(yī)學影像技術(shù)以靈敏度高、無創(chuàng)、全面等特點，成為當前應(yīng)用于腫瘤等重大疑難疾病診斷、分期、療效及預(yù)后評估的最先進手段。因此，采用核醫(yī)學影像技術(shù)實現(xiàn)PD-L1表達的可視化，具有眾多優(yōu)勢：① 一次顯像可檢測原位腫瘤組織及轉(zhuǎn)移病灶；② 能夠多次檢查，篩選免疫治療優(yōu)勢人群及跟蹤治療效果；③ 無創(chuàng)檢查，避免取樣誤差。目前國內(nèi)外已有多個研究小組利用放射性核素標記PD-1/PD-L1抗體，進行腫瘤組織PD-L1表達的可視化研究［15-23］。然而，這些抗體作為分子探針存在很多問題：① 體內(nèi)半衰期過長，血液清除緩慢，一般至少需要24 h才能有效成像；② 非靶向器官的攝取高，靶本比低；③分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性差且易降解，難以大規(guī)模生產(chǎn)；④ 核素標記工藝復(fù)雜，難以應(yīng)用于臨床。

本研究采用的納米抗體是一種天然的、只有重鏈可變區(qū)的獨特抗體，相對分子質(zhì)量只有傳統(tǒng)抗體的1/10，約為15 000，與人源PD-L1具有高親和力，KD值為1.5 ×10-9mol/L。除此之外，該納米抗體還具有以下優(yōu)點：① 設(shè)計的納米抗體與PD-L1抗體藥物結(jié)合腫瘤PD-L1的位點不同，避免影響免疫治療；② 相比于PD-L1抗體，本研究的納米抗體在血液中循環(huán)時間短，較快進入腫瘤組織；③ 非靶向器官攝取少、代謝快，如肺、肝臟和肌肉，短時間內(nèi)可通過腎臟排出體外，靶本比高；④ 只保留具有識別結(jié)合活性的重鏈可變區(qū)，相對分子質(zhì)量小，更容易滲透到腫瘤組織，可減少抗體用量，提高顯像效果；⑤ 分子結(jié)構(gòu)相對簡單、穩(wěn)定性高。

在99mTc標記方面，本研究使用三羰基化合物試劑盒制備標記前體三羰基锝化合物，成功標記了納米抗體。該方法：① 標記步驟簡便、重復(fù)性好；② 標記率和放射化學純度高，大于95%，無需進一步純化，可直接使用；③ 體外穩(wěn)定性良好，HPLC結(jié)果顯示3 h內(nèi)放射化學純度無明顯變化。

本研究的納米抗體相對分子質(zhì)量僅為15 000，遠小于PD-L1抗體及其抗體片段，有助于短時間內(nèi)滲透到腫瘤組織，不僅能在1～2 h內(nèi)獲得有效顯像，還可以選擇目前臨床上最理想SPECT核素99mTc，以獲取更佳的顯像效果。同時，納米抗體與PD-L1蛋白具有高親和力，體外測定KD值為1.5×10-9mol/L，對體內(nèi)腫瘤顯像非常有利。PD-L1高表達組在30 min時，腫瘤有明顯攝取，90 min時仍有高攝取；而顯像期間，PD-L1陰性組腫瘤組織無明顯放射性聚集。此外，納米抗體相對分子質(zhì)量較小且親和力高，有助于獲得良好的藥代動力學性質(zhì)。正如體內(nèi)顯像和生物分布結(jié)果所示，99mTc-PD-L1納米抗體在肺、肝和肌肉等非靶器官低攝取，并且經(jīng)泌尿系統(tǒng)快速排出體外，不僅能獲得高靶本比，還可減少機體受到的輻射劑量?？紤]到PD-1/PD-L1抗體藥物的治療機制是阻斷免疫細胞PD-1與腫瘤細胞上PD-L1結(jié)合，若選用與抗體藥物結(jié)合位點相同的顯像劑，PD-1/PD-L1抗體藥物治療會干擾該類顯像劑對PD-L1表達情況的診斷，因此本研究在設(shè)計該納米抗體時，選擇與PD-L1抗體藥物相同的靶向分子（即腫瘤細胞表面的PD-L1），但靶點位置不同，避免兩者相互影響，以期獲得更加準確的結(jié)果。

上述研究結(jié)果提示，99mTc-PD-L1納米抗體有潛力成為一種方便、快捷及有效的顯像劑，有望成為顯示PD-L1表達、分布以及轉(zhuǎn)移病灶的影像學技術(shù)。99mTc-PD-L1納米抗體有助于篩選優(yōu)勢人群，提高免疫治療效益，監(jiān)測治療效果，避免不必要的治療，尤其是對于組織穿刺活檢顯示為PD-L1陰性者，能夠提供更全面和準確的信息。