湯亞飛 佘小漫 李正剛 于琳 藍國兵 鄧銘光 何自福

摘要 番茄黃化曲葉病毒病是世界番茄生產(chǎn)上一種毀滅性病害，番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV）是引起該病害的主要病原病毒之一。本文采用滾環(huán)擴增及基因克隆方法，獲得了侵染廣東佛山和肇慶番茄的TYLCV 4個分離物全基因組;它們均為2 781 nt，編碼6個ORF，其中病毒鏈上編碼AV1和AV2，互補鏈上編碼AC1、AC2、AC3和AC4。同源性比較結(jié)果表明，4個廣東分離物基因組序列兩兩間同源性為99%以上;與已報道的TYLCV各分離物同源性在90%以上，而與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物的同源率均在98%以上。系統(tǒng)進化分析顯示，廣東分離物與來自中國不同地區(qū)的TYLCV分離物親緣關(guān)系較近，并聚類在一個分支。因此，侵染引起廣東佛山和肇慶番茄黃化曲葉病的病毒應來自國內(nèi)其他地區(qū)。本研究是對TYLCV廣東分離物分子特征的首次報道。

關(guān)鍵詞 番茄黃化曲葉病毒; 分子鑒定; 序列分析

中圖分類號： S 432.41

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018333

番茄黃化曲葉病是世界范圍內(nèi)嚴重影響番茄生產(chǎn)的一種重要病害，已給熱帶和亞熱帶地區(qū)的番茄生產(chǎn)造成嚴重損失[1]。在我國，蔡健和等1994年首次在廣西報道了該病害的發(fā)生[2]。2006年以來，番茄黃化曲葉病在全國范圍大面積暴發(fā)和流行。在廣東，何自福等2003年率先報道番茄黃化曲葉病危害番茄[3]，到目前為止，廣東省幾乎所有番茄產(chǎn)區(qū)均有該病害的發(fā)生。番茄植株感染該病害后主要表現(xiàn)為植株矮化，葉緣黃化，葉片皺縮、卷曲。早期感病時，植株無法正常開花結(jié)果;后期感病，植株上部新葉表現(xiàn)癥狀，結(jié)果量減少，果實變小[4]。

番茄黃化曲葉病是由煙粉虱傳雙生病毒侵染所導致的。全世界已報道可侵染番茄的雙生病毒至少有88種[5]，在我國，已報道的引起番茄黃化曲葉病的雙生病毒至少有16種[616]，其中TYLCV分布最廣，是引起全球各地番茄黃化曲葉病的主要病原之一。該病毒最先在以色列發(fā)現(xiàn)，之后隨著傳播介體煙粉虱在全球范圍暴發(fā)而蔓延至中東、地中海沿岸、非洲、美洲、澳洲和亞洲等多個國家和地區(qū)[17]。在我國，Wu等2006年首次在上海番茄上發(fā)現(xiàn)TYLCV[6]，之后在北京[18]、河北[19]、吉林[20]、陜西[21]、天津[22]、河南[23]、浙江[24]、江蘇[25]、新疆[26]、山東[27]、安徽[28]、福建[29]、湖北[4]、湖南[30]、云南[31]、山西[32]、遼寧[33]、寧夏[34]、甘肅[35]等20個省市番茄產(chǎn)區(qū)均有檢測到該病毒，并造成嚴重損失的報道。在廣東，2004年即有番茄黃化曲葉病的發(fā)生，但直到2011年9月才在佛山市三水區(qū)的番茄產(chǎn)區(qū)檢測到TYLCV。本文對危害廣東番茄的TYLCV全基因組進行了克隆及序列分析，明確了TYLCV廣東分離物的分子特征，為該病毒病監(jiān)測與防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

罹患番茄黃化曲葉病的番茄葉片樣品采自廣東省佛山市三水區(qū)、肇慶市高要市等番茄產(chǎn)區(qū);以TYLCV侵染性克隆注射接種發(fā)病的番茄植株葉片作為陽性對照，以健康番茄植株葉片作為陰性對照。

1.2 供試番茄樣品總DNA提取

取番茄病葉組織100 mg，用北京全式金生物技術(shù)有限公司的植物DNA提取試劑盒（Easy Pure Plant Genomic DNA Kit）抽提其總DNA。具體操作按照試劑盒說明書進行。DNA沉淀溶解于50 μL TE（10 mmol/L Tris-HCl， 1 mmol/L EDTA， pH8.0）溶液中。

1.3 PCR 檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡并引物AV494/CoPR[3637]，對疑似病樣進行PCR檢測。反應體系為：番茄病樣總DNA 1 μL（約20 ng），滅菌水 9.5 μL，PCR Mixer 12.5 μL（TaKaRa公司），10 μmol/L上、下游引物各 1 μL，總體積為 25 μL。反應程序：94℃ 4 min;94℃ 45 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，35個循環(huán);72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 全基因組序列的擴增

取PCR檢測為陽性的病樣總DNA，分別取1.0 μL（約20 ng）為模板，利用TempliPhiTM RCA Kit （GE Healthcare）進行滾環(huán)擴增（rolling circle amplification，RCA），以獲得病毒的全基因組。具體方法按照試劑盒說明書上的步驟進行。RCA反應結(jié)束后，擴增產(chǎn)物分別用BamH Ⅰ限制性內(nèi)切酶進行酶切。酶切反應體系為：RCA產(chǎn)物2 μL、內(nèi)切酶1 μL、10×內(nèi)切酶緩沖液1 μL，總酶切反應體系為10 μL。在37℃條件下酶切2 h以上，然后進行電泳分析。若酶切產(chǎn)物為2.5～3.0 kb，或同時還產(chǎn)生1.3 kb左右的條帶，則克隆這些特異性條帶。

1.5 基因克隆與序列分析

應用瓊脂糖凝膠回收試劑盒（Thermo公司）回收RCA酶切產(chǎn)物，純化后連接到相應酶切的pGEM-3Z載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株DH5α，每個平板隨機挑取3個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。利用DNAStar軟件（DNASTAR Inc，Madison，USA）的SeqMan對所獲得的基因序列進行拼接，利用BLAST程序進行序列相似性搜索，進一步用DNAStar的MegAlign進行序列比較分析，ORF預測使用NCBI網(wǎng)站的ORF Finder，采用MEGA 5.05的鄰接法（neighbor joining，NJ），設置Bootstrapping值為1 000，構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測結(jié)果

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒特異簡并引物AV494和CoPR進行PCR檢測，從采集的疑似番茄黃化曲葉病樣品的總DNA中均擴增到1條與陽性對照大小一致的特異片段，長度為570 bp，而健康植株樣品總DNA中未擴增出任何片段（圖1）。表明疑似病樣中均含有菜豆金色花葉病毒屬病毒。

2.2 病毒分離物基因組的克隆與序列分析

選取PCR檢測為陽性的病樣總DNA，分別進行RCA和酶切反應，RCA產(chǎn)物均能被BamHⅠ切出1條約2.7 kb大小的單一條帶，將2.7 kb大小的條帶進行分子克隆和序列測定，結(jié)果表明，來自廣東番茄的SS11、SS12、SS13、GY01 4個分離物 （GenBank登錄號為：JQ867092、JX128099、KC810892、KF356163）全長大小均為2 781 nt，且兩兩間序列同源率均為99.0%以上。

進一步分析發(fā)現(xiàn)，侵染廣東番茄的4個菜豆金色花葉病毒屬病毒分離物基因組DNA-A結(jié)構(gòu)特征完全一致，為單鏈閉合環(huán)狀，編碼6個ORFs?；蚪M病毒鏈含AV1基因 （308-1 084 nt，編碼CP）和AV2基因 （148-498 nt，編碼與病毒移動相關(guān)蛋白），互補鏈含有AC1基因（1 542-2 615 nt，編碼復制酶）、AC2基因（1 226-1 633 nt，轉(zhuǎn)錄激活蛋白）和AC3基因（1 081-1 485 nt，編碼復制增強蛋白）和AC4基因（2 171-2 464 nt，編碼復制或轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子）。在AV2與AC1之間有1個313 nt的非編碼區(qū)（位于2 616-147 nt），其中含有與雙生病毒復制起始有關(guān)的保守序列TAATATTAC（位于2 775-2 nt）[38]。

BLAST結(jié)果顯示，與廣東分離物 DNA-A序列有較高相似性的序列均為TYLCV分離物。進一步比較發(fā)現(xiàn)（圖2），廣東分離物與來自我國不同地區(qū)的TYLCV 13個分離物以及國外不同國家來源的TYLCV 19個分離物的相似性均為90%以上;其中與來自中國不同地區(qū)的TYLCV 13個分離物的相似性均在98%以上，而與阿曼Tom-48分離物（登錄號：KF229725）相似性最低，為90.2%。

2.3 親緣關(guān)系分析

為了分析TYLCV廣東分離物與已報道的各TYLCV分離物的親緣關(guān)系，將TYLCV廣東分離物及上述32個分離物構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以侵染廣東番茄的臺灣番茄曲葉病毒Tomato leaf curl Taiwan virus（ToLCTWV）白沙分離物（DQ237918）為外組。結(jié)果顯示（圖3），TYLCV 廣東分離物與來自中國不同地區(qū)的13個分離物及國外的11個分離物親緣關(guān)系較近，聚在一個分支，進一步與科威特KISR分離物形成一個大的分支;與日本Mild[Tokai]分離物、西班牙Mild[Spain7297]分離物、留尼汪島分離物、日本Sz分離物4個分離物的親緣關(guān)系較近，而與阿巴代分離物、伊朗分離物及阿曼Tom-48分離物 3個分離物親緣關(guān)系較遠。

3 討論

本研究采用RCA擴增及基因克隆方法，獲得了侵染廣東佛山和肇慶番茄的雙生病毒4個廣東分離物基因組全序列，大小均為 2 781 nt，序列間相似性為99%;這些分離物與TYLCV 13個中國分離物及19個不同國家來源分離物的相似性均大于90%，且與TYLCV 13個中國分離物的相似性均在98%以上。根據(jù)目前國際雙生病毒分類方案[5]，侵染引起廣東佛山和肇慶番茄黃化曲葉病的病毒應該屬于TYLCV分離物。

TYLCV最早發(fā)現(xiàn)于以色列，之后迅速擴散，現(xiàn)已在全球范圍發(fā)生。國內(nèi)最早于2006年在上海番茄上檢測到，隨后成為我國番茄黃化曲葉病的主要病原病毒之一。2003年在廣東首次發(fā)現(xiàn)了番茄黃化曲葉病[3]。自從該病害發(fā)生以來，本團隊一直對廣東省該病害的發(fā)生和病原病毒種類進行鑒定和監(jiān)測，2011年以前，引起廣東省番茄黃化曲葉病的病毒種類為廣東番茄曲葉病毒Tomato leaf curl Guangdong virus（ToLCGdV）、廣東番茄黃化曲葉病毒Tomato yellow leaf curl Guangdong virus（TYLCGdV）和ToLCTWV 3種病毒[1113]。 2011年9月，首次在佛山市三水區(qū)的番茄產(chǎn)區(qū)上檢測到TYLCV，隨后2013年在肇慶市高要市蜆崗鎮(zhèn)番茄也檢測到該病毒?？梢姡琓YLCV也入侵廣東危害番茄，正在成為引起廣東番茄黃化曲葉病的病原病毒之一。 更進一步的序列分析發(fā)現(xiàn)其與侵染中國其他地區(qū)番茄的TYLCV相似性高，親緣關(guān)系近。因此，推測侵染廣東番茄的TYLCV病毒是從國內(nèi)其他發(fā)生TYLCV的地區(qū)通過蔬菜、種苗運輸以及煙粉虱的擴散等途徑傳入、定殖。

本文首次對侵染廣東省番茄的TYLCV進行分子鑒定和序列分析，明確TYLCV廣東分離物的分子特征，對開展TYLCV在我國的擴散、序列變異與進化等方面研究提供了基礎，同時也為廣東省番茄抗病新品種的選育及番茄黃化曲葉病的防控提供了科學依據(jù)。

參考文獻

[1] HANSSEN I M， LAPIDOT M， THOMMA B P H J. Emerging viral diseases of tomato crops [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions， 2010， 23： 539548.

[2] 蔡健和，王蘇燕，王小鳳，等.番茄曲葉病及其血清學和PCR測定[J].微生物學報，1995，35（5）：394396.

[3] 何自福，虞皓.警惕廣東番茄煙粉虱傳雙生病毒病的發(fā)生[J].廣東農(nóng)業(yè)科學，2003（4）：4143.

[4] 湯亞飛，何自福，杜振國，等.番茄黃化曲葉病毒在湖北首次報道[J].植物保護，2015，41（5）：233236.

[5] BROWN J K， ZERBINI F M， NAVAS-CASTILLO J， et al. Revision of Begomovirus taxonomy based on pairwise sequence comparisons [J].Archives of Virology，2015，160（6）：15931619.

[6] WU J B， DAI F M， ZHOU X P.First report of Tomato yellow leaf curl virus in China [J].Plant Disease， 2006， 90（10）： 1359.

[7] LI Z H， ZHOU X P， ZHANG X， et al. Molecular characterization of tomato-infecting begomoviruses in Yunnan， China [J].Archives of Virology， 2004， 149（9）： 17211732.

[8] 劉玉樂，蔡健和，李冬玲，等.中國番茄黃化曲葉病毒——雙生病毒的一個新種[J].中國科學（C輯），1998，28（2）：145153.

[9] YANG Xiuling， GUO Wei， MA Xinying， et al. Molecular characterization of Tomato leaf curl China virus， infecting tomato plants in China， and functional analyses of its associated betasatellite [J].Applied & Environmental Microbiology，2011，77（9）：30923101.

[10]ZHANG Hui， HU Gaojie， ZHOU Xueping. Molecular characterization of Tomato leaf curl Hainan virus， a new Begomovirus， and evidence for recombination [J]. Journal of Phytopathology， 2010， 158（11/12）： 829832.

[11]何自福，虞皓，毛明杰，等.中國臺灣番茄曲葉病毒侵染引起廣東番茄黃化曲葉病[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2007，15（1）：119123.

[12]何自福，虞皓，羅方芳.廣東番茄曲葉病毒G3分離物基因組DNA-A的分子特征[J].植物病理學報，2005，35（3）：208213.

[13]何自福，虞皓，羅方芳.廣東番茄曲葉病毒G2分離物基因組DNA-A的分子特征[J].微生物學報，2005，45（1）：4852.

[14]XU Youping， CAI Xinzhong， ZHOU Xueping. Tomato leaf curl Guangxi virus is a distinct monopartite Begomovirus species [J]. European Journal of Plant Pathology， 2007， 118（3）： 287294.

[15]ZHANG Hui， MA Xinying， QIAN Yajun， et al. Molecular characterization and infectivity of Papaya leaf curl China virus infecting tomato in China [J]. Journal of Zhejiang University-Science B （Biomedicine & Biotechnology），2010，11（2）：109114.

[16]DING M， LI T， FANG Q， et al. Tomato yellow leaf curl Yunnan virus， a new Begomovirus species associated with tomato yellow leaf curl disease in China [J]. Journal of Plant Pathology， 2016， 98（2）： 337340.

[17]MORIONES E， NAVAS-CASTILLO J. Tomato yellow leaf curl virus， an emerging virus complex causing epidemics worldwide [J]. Virus Research， 2000， 71： 123134.

[18]宋晰，師迎春，張世晨，等.北京地區(qū)番茄黃化曲葉病病毒分離物測定及株系的初步鑒定[J].植物病理學報，2013，43（2）：113119.

[19]周瑩，李興紅，劉建華，等.河北省番茄黃化曲葉病毒病的分子鑒定初報[J].植物保護，2010，36（1）：6064.

[20]王祥，李剛，趙黎明，等.吉林番茄黃化曲葉病毒分離物的檢測及其DNA-A全基因組序列分析[J].植物保護，2014，40（2）：7680.

[21]阮濤，楊會房，楊水英，等.分離自陜西涇陽番茄的番茄黃化曲葉病毒（TYLCD）的分子特征[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學報，2013，21（1）：97105.

[22]金鳳媚，薛俊，郟艷紅，等.天津地區(qū)番茄黃化曲葉病毒DNA-A的克隆和序列分析[J].華北農(nóng)學報，2011，26（1）：5862.

[23]于云奇，阮濤，楊水英，等.河南省番茄黃化曲葉病病原分子鑒定及全基因組序列分析[J].西南大學學報（自然科學版），2014，36（1）：1317.

[24]袁偉，萬紅建，王榮青，等.浙江省番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定及序列分析[J].分子植物育種，2013，11（2）：185192.

[25]季英華，熊如意，程兆榜，等.江蘇省番茄黃化曲葉病的病原分子診斷[J].園藝學報，2008，35（12）：18151818.

[26]王喜剛，黃家風，都業(yè)娟.南疆溫室番茄黃化曲葉病病毒種類的分子鑒定[J].植物保護學報，2013，40（3）：237242.

[27]褚棟，侯麗霞，劉國霞，等.山東省局部地區(qū)番茄黃化曲葉病毒的分子鑒定[J].山東農(nóng)業(yè)科學，2010（2）：1315.

[28]余文貴，趙統(tǒng)敏，楊瑪麗，等.山東、安徽兩省栽培番茄煙粉虱傳雙生病毒的PCR檢測及序列分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學報，2009，25（4）：747751.

[29]張潔，林文武，宛柏杰，等.福州番茄黃化曲葉病毒的全基因組結(jié)構(gòu)特征[J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2016，45（5）：501504.

[30]班一云，丁波，周雪平.湖南省番茄和牽?；ㄉ想p生病毒的分子鑒定[J].植物保護，2017，43（4）：134138.

[31]劉微，史曉斌，唐鑫，等.云南番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復合侵染的分子鑒定[J].園藝學報，2018，45（3）：552560.

[32]郝浩永，滕紅梅，關(guān)正君，等.山西運城番茄黃化曲葉病毒的初步鑒定[J].分子植物育種，2018，16（5）：15581565.

[33]楊彩霞，張帥宗，孫蓬蓬，等.番茄黃化曲葉病毒遼寧葫蘆島分離物的檢測和序列分析[J].福建農(nóng)林大學學報（自然科學版），2016，45（4）：376380.

[34]沙龍，高艷明，李建設.寧夏番茄黃化曲葉病毒病分子鑒定及防控措施[J].北方園藝，2013（12）：119121.

[35]胡志峰，邵景成.甘肅省設施番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與防治[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技，2014（1）：5456.

[36]WYATT S D， BROWN J K. Detection of subgroup Ⅲ geminivirus isolates in leaf extracts by degenerate primers and polymerase chain reaction [J]. Phytopathology， 1996， 86（12）： 12881293.

[37]何自福， 虞皓， 羅方芳. 番茄煙粉虱傳雙生病毒PCR檢測[J]. 中國病毒學， 2004， 19（1）： 6769.

[38]HANLEY-BOWDOIN L， SETTLAGE S B， OROZCO B M， et al. Geminiviruses： models for plant DNA replication， transcription， and cell cycle regulation[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 1999， 18（1）： 71106.

（責任編輯：田 喆）