唐恩紅，蔡旺

0 引言

茯苓又稱茯菟，是具有利水滲濕、健脾胃、寧心安神作用的多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核[1]。茯苓多糖是茯苓的主要化學(xué)成分之一，其他主要化學(xué)成分還有三萜、脂肪酸、甾醇等。臨床及現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明茯苓多糖具有抗病毒、抗腫瘤活性、減輕放化療不良反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能、抗炎、抗衰老等藥理作用[2-3]。研究表明，茯苓多糖能夠抑制胃癌[4]、卵巢癌[5]、肺癌[6]等多種腫瘤細(xì)胞的增殖。但針對宮頸癌細(xì)胞這方面的研究較少見，且其促凋亡作用機(jī)制的相關(guān)研究也不十分清楚。本文研究了其促凋亡作用與ERK信號(hào)通路的關(guān)系，證實(shí)茯苓多糖是通過下調(diào)p-ERK1/2表達(dá)，抑制ERK信號(hào)通路發(fā)揮促凋亡作用的。除此之外，本文還對其是否有促進(jìn)遷移方面的影響做了相關(guān)研究。希望通過研究茯苓多糖對HeLa細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移的影響，探究其發(fā)揮抗腫瘤機(jī)制的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，以期為茯苓多糖的臨床治療和臨床用藥范圍提供有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

茯苓多糖粉末購于南通飛宇生物科技有限公司，以無菌水充分溶解后，制成母液濃度，0.22 μm濾膜無菌過濾除菌，用培養(yǎng)基稀釋至目的濃度；人宮頸癌HeLa細(xì)胞由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室友情提供；高糖DMEM培養(yǎng)基、青-鏈霉素、二甲基亞砜（DMSO）均購于沈陽科碩商貿(mào)公司；胎牛血清購于上海賓智生物科技有限公司；MTT購于廈門研科生物技術(shù)有限公司；Hoechst33342染色液購于北京碧云天生物科技有限公司；Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司；Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9、Bcl-2、Bax、MMP-9、VEGFA、p-ERK1/2、ERK1/2抗體均購于沈陽萬類生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)。每2天更換1次完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞鋪滿皿底后按1:3傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞增殖率 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/毫升，100 μl每孔接種于96孔板。貼壁后加入不同濃度的茯苓多糖，于不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入MTT和DMSO，室溫振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞存活率。并篩選出適宜的低、中、高濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5 000個(gè)/孔接種于6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后加入不同濃度的茯苓多糖，藥物作用24 h后，于倒置相差顯微鏡下觀察不同濃度藥物對HeLa細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量、生長速度的影響并拍照。

1.2.4 Hoechst33342染色法熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核變化 細(xì)胞處理同1.2.3，藥物作用24 h后，Hoechst33342染料避光染色并置于培養(yǎng)箱作用30 min，PBS避光洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察分析細(xì)胞核形態(tài)變化并拍照。

1.2.5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，細(xì)胞濃度為500個(gè)/孔，接種于6孔板，培養(yǎng)于含不同濃度藥物的完全培養(yǎng)基中，至出現(xiàn)細(xì)胞集落時(shí)終止培養(yǎng)。4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色，漂洗干凈后常溫晾干，計(jì)數(shù)各組細(xì)胞的細(xì)胞克隆數(shù)量并拍照。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移率 細(xì)胞處理同1.2.3，細(xì)胞培養(yǎng)貼壁后，用100 μl槍頭于每個(gè)孔做“十字形”劃痕，于含不同藥物濃度的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。顯微鏡下觀察未加藥、加藥12 h、加藥24 h和加藥36 h的細(xì)胞生長密度、形態(tài)及劃痕面積等變化情況并拍照。Image J軟件進(jìn)行劃痕面積分析。

1.2.7 Annexin V-FITC/PI法檢測細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞，接種于6孔板內(nèi)，貼壁后分別加入不同濃度的茯苓多糖，藥物作用24 h后，胰酶（不含EDTA）室溫消化，完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)，預(yù)冷的PBS漂洗細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，1200 r/min、4℃離心5 min，收集2×105個(gè)細(xì)胞。依次加入100 μl 1×Binding Buffer、5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min。再加入400 μl 1×Binding Buffer，徹底混勻后置于冰上，1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.8 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 細(xì)胞處理同1.2.7，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/毫升。 70%冷乙醇固定過夜。染色前用預(yù)冷PBS洗去固定液，加入100 μl RNase A，37℃水浴30 min，再加入500 μl PI，混勻后4℃避光30 min。流式細(xì)胞儀檢測分析細(xì)胞周期。

1.2.9 Western blot法檢測增殖、凋亡、遷移、ERK通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞，貼壁后分別加入不同濃度的茯苓多糖，藥物作用24 h后，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，于冰上加入裂解液，-20℃裂解過夜后，12 000 r/min、4℃離心25 min，收集總蛋白，BCA法測定相應(yīng)蛋白濃度并分別稀釋至相同的終濃度。取等量蛋白進(jìn)行SDSPAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，封閉1 h，加入相應(yīng)抗體，β-actin作為內(nèi)參，4℃孵化過夜。TBST洗膜3次，加入相應(yīng)二抗室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL發(fā)光液顯色，自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀采集圖像。Image J軟件進(jìn)行灰度分析，以目的蛋白與內(nèi)參的吸光度比值表示相對蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞增殖率的影響

當(dāng)藥物濃度大于30 mg/ml時(shí)，與對照組相比，有明顯的增殖抑制作用，并隨藥物濃度增加，其增殖抑制作用越明顯（P＜0.05）。當(dāng)藥物濃度大于60 mg/ml時(shí)，可使細(xì)胞活力下降接近或超過50%的效應(yīng)。為防高濃度可能會(huì)直接殺死細(xì)胞，導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)取材時(shí)所獲細(xì)胞數(shù)引起偏差而造成實(shí)驗(yàn)較大誤差，取30、40、50 mg/ml茯苓多糖作為低、中、高濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖1、表1。

圖1 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞存活率的影響Figure1 Pachymaran inhibited viability of HeLa cells

表1 不同濃度茯苓多糖作用24h后HeLa細(xì)胞的存活率Table1 Viability of HeLa cells treated with different dosage of pachyamran for 24h

2.2 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞的形態(tài)學(xué)影響

對照組的細(xì)胞呈不規(guī)則的多邊形，生長密集，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞輪廓清晰。藥物處理24 h后，細(xì)胞間連接疏松或脫壁，細(xì)胞形態(tài)變圓或有逐漸向梭形變化的趨勢，數(shù)量減少，培養(yǎng)基上清中漂浮著較多透亮的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，胞質(zhì)、胞核可見較多顆粒，且上述改變隨藥物濃度增加更加顯著，見圖2。

圖2 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞形態(tài)的影響 (×200)Figure2 Morphology of HeLa cells after pachymaran treatment (×200)

2.3 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞核形態(tài)的影響

茯苓多糖作用24 h后，與對照組細(xì)胞相比，中、高濃度組可見明顯的核膜皺縮，呈碎塊狀、新月形，致密濃染，細(xì)胞核大小不均勻，輪廓不清，顏色明顯發(fā)白。且隨著藥物濃度增加，細(xì)胞形態(tài)變化更顯著。對照組細(xì)胞呈均勻的藍(lán)色，核膜完整，細(xì)胞大小較勻稱，見圖3。

2.4 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞克隆形成能力的影響

與對照組相比，藥物組的細(xì)胞克隆形成能力明顯減弱，并隨著藥物濃度的增加其抑制克隆形成能力越明顯，見圖4。

2.5 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞向劃痕內(nèi)遷移的影響

圖3 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞核形態(tài)的影響 (×200)Figure3 Nuclear morphology of HeLa cells after pachymaran treatment (×200)

圖4 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞克隆形成能力的影響Figure4 Effects of pachymaran on cloning ability of HeLa cells

以不同濃度藥物作用不同時(shí)間后的細(xì)胞遷移能力較對照組都受到明顯抑制（12 h, 30 mg/ml:t=7.752, P＜0.01； 40 mg/ml: t=3.989, P＜0.01； 50 mg/ml: t=4.734, P＜0.05； 24 h, 30 mg/ml: t=2.315,P＜0.01； 40 mg/ml: t=3.989, P＜0.01； 50 mg/ml:t=4.734, P＜0.01； 36 h, 30 mg/ml: t=2.315, P＜0.01；40 mg/ml: t=3.989, P＜0.01； 50 mg/ml: t=4.734,P＜0.01），且隨著藥物濃度和作用時(shí)間延長，其對細(xì)胞遷移的抑制作用越明顯，見圖5。

圖5 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞遷移率的影響Figure5 Migration rate of HeLa cells after pachymaran treatment

2.6 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率

茯苓多糖作用24 h后，與對照組相比，HeLa細(xì)胞凋亡率顯著增加，且呈劑量相關(guān)性（30 mg/ml:t=9.525, P＜0.01； 40 mg/ml: t=13.109, P＜0.01； 50 mg/ml:t=15.233, P＜0.01）。其中，晚期凋亡和壞死細(xì)胞的比例較早期凋亡細(xì)胞明顯增加，見圖6。

2.7 茯苓多糖對細(xì)胞周期的影響

茯苓多糖作用24 h后，與對照組相比，S期細(xì)胞比例明顯減少，而G2/M期細(xì)胞比例增加（P＜0.01），提示茯苓多糖能使HeLa細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，從而抑制細(xì)胞增殖，并呈劑量相關(guān)性，見圖7、表2。

2.8 茯苓多糖對凋亡、遷移、周期及ERK通路相關(guān)蛋白的影響

2.8.1 茯苓多糖對凋亡相關(guān)蛋白的影響 作用24 h后，與對照組相比，低、中、高濃度的茯苓多糖都能使Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9和Bax的表達(dá)明顯增加，Bcl-2的表達(dá)明顯減少，且呈劑量相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖8、表3。

圖6 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞凋亡率的影響Figure6 Effect of pachymaran on apoptosis of HeLa cells

圖7 茯苓多糖對HeLa細(xì)胞周期的影響Figure7 Cell cycle of HeLa cells after pachymaran treatment

表2 不同濃度茯苓多糖作用24h后HeLa細(xì)胞周期Table2 Cell cycle of HeLa cells treated with different pachymaran dosage for 24h

圖8 茯苓多糖對凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure8 Effect of pachymaran on expression of apoptosisrelated proteins

表3 低、中、高濃度組細(xì)胞的凋亡蛋白相對表達(dá)量 (n=5, x±s)Table3 Relative expression of apoptotic proteins in low, medium and high concentration groups (n=5, x±s)

2.8.2 茯苓多糖對遷移相關(guān)蛋白MMP-9、VEGFA的影響 作用24 h后，與對照組（100.00±0.00）相比，低、中、高濃度的茯苓多糖都能使MMP-9（30 mg/ml:（92.43±6.01）、P=0.000, 40 mg/ml:（78.26±4.33）、P=0.000和50 mg/ml:（61.92±2.57）、P=0.001）和VEGFA（30 mg/ml:（87.59±5.43）、P=0.000, 40 mg/ml:（80.72±4.29）、P=0.000和 50 mg/ml:（64.18±2.58）、P=0.000）的表達(dá)逐漸減少，且呈劑量相關(guān)性，見圖9。

2.8.3 茯苓多糖對ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響 作用24 h后，與對照組相比，低、中、高濃度的茯苓多糖都能明顯抑制p-ERK1/2的表達(dá)，且呈劑量相關(guān)性，但與ERK1/2的表達(dá)無明顯趨勢。提示茯苓多糖可能是通過抑制ERK通路的活化下調(diào)p-ERK1/2的表達(dá)而發(fā)揮其促凋亡的作用，見圖10、表4。

圖9 茯苓多糖對遷移相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure9 Effect of pachymaran on expression of migrationrelated proteins

圖10 茯苓多糖對ERK通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure10 Effect of pachymaran on expression of ERK pathway-related proteins

表4 低、中、高濃度組細(xì)胞的ERK通路蛋白相對表達(dá)量(n=5,)Table4 Relative expression of ERK pathway proteins in low, medium and high concentration groups (n=5, x±s)

表4 低、中、高濃度組細(xì)胞的ERK通路蛋白相對表達(dá)量(n=5,)Table4 Relative expression of ERK pathway proteins in low, medium and high concentration groups (n=5, x±s)

Groups p-ERK1/2 P ERK1/2 P Control 100.00±0.00 100.00±0.00 Pachymaran 30 mg/ml 88.10±1.93 0.000 111.05±1.18 0.428 40 mg/ml 73.35±7.53 0.000 108.94±6.20 0.721 50 mg/ml 64.12±4.25 0.000 107.40±4.38 0.194

3 討論

宮頸癌是最常見的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率呈逐年上升且有年輕化趨勢[7]。傳統(tǒng)治療方法主要包括手術(shù)和放化療，但臨床研究證實(shí)不同患者對放化療敏感度的差異較大，且患者往往不能耐受為改善療效而增加放化療藥物劑量所帶來的不良反應(yīng)[8]。天然藥物因其具有多靶點(diǎn)、來源豐富等特點(diǎn)，故尋找一種高效的天然藥物治療宮頸癌已成為婦科腫瘤的研究方向之一。

本實(shí)驗(yàn)旨在探究茯苓多糖誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、遷移、促凋亡的作用及其機(jī)制，尋找發(fā)揮抗腫瘤作用的關(guān)鍵位點(diǎn)，為制定宮頸癌治療方案提供新思路。通過對細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察、MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)等證實(shí)了茯苓多糖能有效降低HeLa細(xì)胞增殖率、誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核破碎、染色質(zhì)凝集等凋亡形態(tài)學(xué)改變。流式檢測細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期以及Weatern blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)同樣也證實(shí)了茯苓多糖的促凋亡作用。

我們研究認(rèn)為茯苓多糖的促凋亡機(jī)制之一可能是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的。Weatern blot結(jié)果表明，隨著藥物濃度增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)減少，促凋亡蛋白Bax的表達(dá)增加，Bcl-2/Bax比值下降，從而引起線粒體膜的通透性發(fā)生改變，使得細(xì)胞色素C的含量增加，與半胱氨酸蛋白酶結(jié)合形成的凋亡體的含量也增加，最終Caspase家族被激活，凋亡通路上游蛋白Caspase 8、Caspase 9合成增加，隨后激活Caspase 3形成Cleaved Caspase 3，則凋亡不可逆轉(zhuǎn)[9-10]。

腫瘤細(xì)胞的浸潤性和轉(zhuǎn)移性是其不可被治愈的重要原因，也是影響預(yù)后的主要原因。有研究表明，基質(zhì)類金屬蛋白酶家族調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)、破壞基底膜屏障、促進(jìn)新生血管形成等途徑促使細(xì)胞生長和遷移，為腫瘤細(xì)胞的遷移、浸潤和轉(zhuǎn)移提供有利條件。研究顯示，MMP-9在腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞刺激的宮頸癌細(xì)胞中高表達(dá)[12]。血管內(nèi)皮因子A（VEGFA）可直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的新生血管形成，參與腫瘤細(xì)胞的增殖和營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，MMP-9和VEGFA表達(dá)減少，且呈劑量相關(guān)性。提示茯苓多糖具有抑制HeLa遷移的能力。

E R K信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）的主要成員之一。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）包括ERK1和ERK2，是將信號(hào)從表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，正常定位于胞質(zhì)，激活后轉(zhuǎn)位至胞核，磷酸化激活的ERK1/2由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)多種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活化，參與細(xì)胞的存活、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的癌變等多種生物學(xué)反應(yīng)[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增加，p-ERK1/2的表達(dá)明顯減少，且呈劑量相關(guān)性。但ERK1/2的表達(dá)無明顯變化，說明茯苓多糖能明顯下調(diào)ERK1/2磷酸化水平，從而阻斷ERK信號(hào)通路。

綜上所述，茯苓多糖具有抑制HeLa細(xì)胞增殖、促凋亡作用。其機(jī)制可能與通過下調(diào)p-ERK1/2表達(dá)，抑制ERK信號(hào)通路磷酸化有關(guān)。另外，線粒體途徑也是茯苓多糖實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡的重要方式之一。除此之外，茯苓多糖對于抑制HeLa細(xì)胞遷移也有明顯的作用，具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。