陳秋丹，陳淑英

0 引言

膠質(zhì)瘤（glioma）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)腫瘤的40%～50%。目前即使聯(lián)合手術(shù)、放療和化療等多種治療手段，惡性膠質(zhì)瘤的中位生存期仍只有診斷后14.6月[1]。膠質(zhì)瘤的總體治愈率近10年來(lái)沒(méi)有得到顯著提高，原因在于其富血管性和高侵襲性。微小RNAs（microRNAs, miRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)度約18～24個(gè)核苷的小的、非編碼RNA分子，通過(guò)與靶基因mRNA 3’-UTR區(qū)域配對(duì)調(diào)控基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、凋亡、周期、增殖和分裂等生理病理過(guò)程[2-5]，如今以miRNAs為基礎(chǔ)治療的方法已經(jīng)得到越來(lái)越多的關(guān)注[6-7]。在膠質(zhì)瘤中，已有多種miRNAs被證實(shí)異常表達(dá)并存在包括miR-26a、miR-769-3p、miR-218在內(nèi)的miRNAs網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)[8]，其中miR-218也被報(bào)道在多種腫瘤中扮演抑癌基因的角色，如胃癌、肺癌等[9-10]，但其在膠質(zhì)瘤中的研究仍然相對(duì)較少，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218在臨床膠質(zhì)瘤樣本中的表達(dá)情況，并探究miR-218對(duì)膠質(zhì)瘤血管生成的影響，進(jìn)一步挖掘了其潛在分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)p70s6k1是miR-218影響膠質(zhì)瘤進(jìn)展的新靶點(diǎn)。P70s6k1是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及血管新生的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，主要促進(jìn)蛋白質(zhì)的翻譯，受磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）以及哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶標(biāo)（mTOR）信號(hào)途徑的調(diào)節(jié)，PI3K/Akt/mTOR/p70s6k1信號(hào)通路已經(jīng)被公認(rèn)在促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、侵襲、抗凋亡及促進(jìn)血管生成等細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。本實(shí)驗(yàn)為今后臨床研究和分子靶向治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和組織標(biāo)本

人膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；裸鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；28例臨床組織標(biāo)本（依據(jù)WHO病理分級(jí)，癌旁組織7例及膠質(zhì)瘤2/3/4級(jí)各7例）來(lái)自上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院神經(jīng)外科，病例組織樣本均來(lái)自手術(shù)切除標(biāo)本，并且通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核（倫（2016-10）號(hào)）。

1.2 穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建

通過(guò)慢病毒感染U87細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-NC和miR-218的細(xì)胞株（U87/miR-NC和U87/miR-218），并在此基礎(chǔ)上對(duì)U87/miR-NC和U87/miR-218穩(wěn)定細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染Scramble和（或）p70s6k1質(zhì)粒，構(gòu)建三組不同表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞株（U87/miR-NC+Scramble、U87/miR-218+Scramble及U87/miR-218+p70s6k1），觀察不同組產(chǎn)生的條件培養(yǎng)基在體外對(duì)微管形成的影響，同時(shí)裸鼠基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)觀察不同組細(xì)胞在體內(nèi)對(duì)血管新生的影響。

1.3 小管形成實(shí)驗(yàn)

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（H U V E C）在含有0.2%FBS的EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，用于小管形成測(cè)定。用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)U87/miR-218和U87/miR-NC細(xì)胞24 h后，收集條件培養(yǎng)基，并儲(chǔ)存在-20℃以備用。將HUVEC細(xì)胞消化計(jì)數(shù)并重懸于EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，將細(xì)胞與等體積的條件培養(yǎng)基混合，并以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種在Matrigel預(yù)處理的96孔板上。12 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察小管形成。使用CellSens Standard軟件測(cè)量每個(gè)孔管的總長(zhǎng)度。另外三組不同表達(dá)狀態(tài)的細(xì)胞（U87/miR-NC+Scramble, U87/miR-218+Scramble, U87/miR-218+p70s6k1）進(jìn)行相同處理。

1.4 裸鼠基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)

收獲穩(wěn)定表達(dá)miR-218和miR-NC（陰性對(duì)照）的U87細(xì)胞并重懸浮在無(wú)血清培養(yǎng)基中。取將100 μl細(xì)胞懸液（約含細(xì)胞2×106個(gè)）與200 μl Matrigel混合后立即注射到裸鼠的兩側(cè)。植入后第11天，處死裸鼠并剝離基質(zhì)膠栓塞，測(cè)量血紅蛋白。另外三組不同表達(dá)狀態(tài)的細(xì)胞（U87/miRNC+Scramble, U87/miR-218+Scramble, U87/miR-218+p70s6k1）進(jìn)行相同處理。

1.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞或組織蛋白，取等量10～20 μg蛋白在80 V下電泳。冰浴條件下90 V電轉(zhuǎn)110 min將分離膠上的條帶蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，電泳結(jié)束后取下PVDF膜。將PVDF膜浸于封閉液中1 h，洗滌后一抗4℃（1:1 000）孵育過(guò)夜，洗滌后二抗（1:5 000）孵育2 h，暗室顯影。以GAPDH為內(nèi)參檢測(cè)各組細(xì)胞中p70s6k1蛋白表達(dá)水平。

1.6 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）

用TRIzol試劑根據(jù)試劑盒操作方法提取組織或細(xì)胞RNA，轉(zhuǎn)錄全程cDNA或miR-218，采用GAPDH作為內(nèi)參檢測(cè)各組細(xì)胞中p70s6k1的mRNA水平，以U6基因?yàn)閮?nèi)參檢測(cè)不同細(xì)胞與組織中miR-218的表達(dá)水平，按照各自程序進(jìn)行擴(kuò)增。

1.7 報(bào)告基因檢測(cè)

構(gòu)建靶基因p70s6k1 3’-UTR的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（wt）及其核心序列突變的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒（mut）。分別將pMIR-p70s6k1-WT、 pMIR-p70s6k1-mut、海腎熒光基因質(zhì)粒以及miR-NC、miR-218共同轉(zhuǎn)染U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞，24 h后將培養(yǎng)基吸棄，每孔加入200 μl裂解緩沖液，振蕩15 min，充分裂解細(xì)胞，取80 μl裂解液加入96孔板中，Glo-Max檢測(cè)儀檢測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)不少于3次的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)算得平均值并用GraphPad Prism 5進(jìn)行相關(guān)分析，組間數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 5進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MiR-218在臨床膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)下調(diào)并與WHO分級(jí)相關(guān)

qRT-PCR結(jié)果顯示，相較于癌旁組織，膠質(zhì)瘤組織中miR-218的表達(dá)量明顯減少，見(jiàn)圖1A。此外，隨著膠質(zhì)瘤WHO病理級(jí)別的升高，miR-218的表達(dá)量逐漸降低，提示miR-218的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)，見(jiàn)圖1B。

2.2 MiR-218抑制膠質(zhì)瘤新血管生成的能力

圖1 MiR-218在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)下降(A)且與膠質(zhì)瘤WHO分級(jí)相關(guān)(B)Figure1 MiR-218 expression was down-regulated in glioma tissues (A) and associated with WHO stage(B)

小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，由過(guò)表達(dá)miR-218的U87細(xì)胞制備的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的HUVEC細(xì)胞微管形成數(shù)量明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。通過(guò)裸鼠基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，U87/miR-218組血管生成較U87/miR-NC組顯著降低，見(jiàn)圖2B。

2.3 MiR-218直接靶向p70s6k1

MiRNAs調(diào)控基因表達(dá)的主要方式是與目標(biāo)基因mRNA3’-UTR區(qū)域配對(duì)結(jié)合從而誘導(dǎo)靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯。通過(guò)生物信息學(xué)軟件發(fā)現(xiàn)miR-218可與p70s6k1的3’-UTR一段序列相匹配，見(jiàn)圖3A。此外，熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果表明miR-218通過(guò)與靶基因p70s6k1 3’-UTR序列互補(bǔ)結(jié)合從而抑制野生型報(bào)告基因pMIR-p70s6k1-wt活性，但對(duì)其突變型報(bào)告基因pMIR-p70s6k1-mut卻無(wú)明顯作用，見(jiàn)圖3B。免疫印跡實(shí)驗(yàn)顯示過(guò)表達(dá)miR-218顯著降低p70s6k1的蛋白表達(dá)水平，見(jiàn)圖3C。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-218的細(xì)胞株中p70s6k1的mRNA水平降低，證明miR-218可以在轉(zhuǎn)錄水平抑制p70s6k1，從而減少其蛋白水平的表達(dá)。

2.4 過(guò)表達(dá)p70s6k1可逆轉(zhuǎn)miR-218對(duì)膠質(zhì)瘤血管新生的抑制作用

小管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)miR-218組能在體內(nèi)外顯著抑制血管新生，見(jiàn)圖4A，而同時(shí)裸鼠基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)也證明過(guò)表達(dá)p70s6k1的miR-218組血管新生作用被部分逆轉(zhuǎn)，見(jiàn)圖4B。

圖2 MiR-218抑制膠質(zhì)瘤新血管生成的能力Figure2 MiR-218 inhibited glioma angiogenesis in vitro and vivo

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外各項(xiàng)研究均表明miR-218在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了抑癌基因的作用且與腫瘤的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)[12-13]，已有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-218可以通過(guò)靶向E2F2、LHFPL3、HMGB1、Robo1等基因調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展并能通過(guò)靶點(diǎn)與其他miRNAs相互聯(lián)系形成網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)[8,14-17]。此外，有學(xué)者統(tǒng)計(jì)了98例膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織中miR-218的表達(dá)情況并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-218的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的WHO分級(jí)和卡氏評(píng)分（Karnofsky performance score, KPS）密切相關(guān)，并與患者的無(wú)病生存期和總生存期獨(dú)立相關(guān)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與前期文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果吻合，通過(guò)對(duì)7例癌旁組織樣本及21例不同級(jí)別膠質(zhì)瘤組織樣本進(jìn)行檢測(cè)，也發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤組織中miR-218表達(dá)降低，且隨著膠質(zhì)瘤WHO級(jí)別的增高，表達(dá)水平越低，但因樣本量不多，可能存在個(gè)體差異性，實(shí)驗(yàn)存在局限性，后期實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)擴(kuò)大樣本量的收集，并進(jìn)行miR-array芯片的分析，以明確膠質(zhì)瘤中miR-218的表達(dá)情況及與膠質(zhì)瘤級(jí)別的關(guān)系。

圖3 MiR-218直接靶向p70s6k1Figure3 MiR-218 directly targeted p70s6k1

圖4 過(guò)表達(dá)p70s6k1可部分逆轉(zhuǎn)miR-218對(duì)膠質(zhì)瘤血管新生的抑制作用Figure4 Overexpression of p70s6k1 could partially reverse inhibition effect of miR-218 on glioma angiogenesis

此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miR-218對(duì)膠質(zhì)瘤血管新生的生物學(xué)功能抑制作用較為明顯，經(jīng)過(guò)深入研究其調(diào)控機(jī)制發(fā)現(xiàn)，miR-218能直接靶向p70s6k1。PI3K/mTOR/p70s6k1在多項(xiàng)研究中均被證明在腫瘤血管生成等細(xì)胞生物學(xué)功能上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，且mTOR/p70s6k1已經(jīng)被證明為癌癥治療過(guò)程中最重要的靶標(biāo)之一[19-20]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)逆轉(zhuǎn)p70s6k1后發(fā)現(xiàn)miR-218對(duì)血管新生的功能被部分逆轉(zhuǎn)，因此確認(rèn)miR-218確實(shí)可通過(guò)p70s6k1調(diào)控腫瘤血管生成，但本實(shí)驗(yàn)并未深入闡明其相關(guān)的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，且細(xì)胞品種選擇較為單一，計(jì)劃后續(xù)在其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中進(jìn)行功能及機(jī)制的驗(yàn)證。

綜上，本實(shí)驗(yàn)確定了miR-218新的靶基因，從對(duì)miR-218的功能研究深入到機(jī)制研究，通過(guò)對(duì)臨床組織樣本的檢測(cè)分析，并結(jié)合各類(lèi)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及裸鼠基質(zhì)膠塞實(shí)驗(yàn)，闡明miR-218/p70s6k1影響膠質(zhì)瘤血管生成上的作用，為膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供理論依據(jù)，同時(shí)為應(yīng)用miR-218/p70s6k1調(diào)控軸作為腫瘤治療靶點(diǎn)進(jìn)行膠質(zhì)瘤治療奠定理論基礎(chǔ)。