李炳欽，楊玲，*，汪河濱，陳龍，阿力騰阿依

（1.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，塔里木盆地生物資源保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300；2.北京化工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京市生物加工過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100029）

新疆藥桑在植物分類學(xué)上屬?？疲?，黑桑種（Morus nigra L.）[1]。原產(chǎn)于伊朗，十六世紀(jì)引入新疆栽培。由于新疆光熱資源豐富，環(huán)境惡劣，造成其成為及其罕見的22 倍體桑品種資源[2-3]。現(xiàn)廣泛栽培于和田、阿克蘇和喀什地區(qū)。藥桑作為維吾爾族傳統(tǒng)藥材，具有多種功效，廣泛用于消炎、補(bǔ)血和鎮(zhèn)靜[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)藥桑中成分具有抗氧化、降血糖、降血脂、抗腫瘤等多種藥理活性[5-7]，引起國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。

藥桑葉作為藥桑產(chǎn)物，每年產(chǎn)量巨大。有研究表明[6-8]，藥桑葉中營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分含量豐富，相比桑葉（Morus alba L.），藥桑葉在總多糖、總黃酮和總生物堿等含量上優(yōu)于桑葉，可利用價(jià)值較高。藥桑中總黃酮、總生物堿在抗氧化、降血糖等方面發(fā)揮著重要作用[6]。然而目前在對藥桑葉生物活性的研究不夠全面深入徹底，對藥桑葉綜合利用開發(fā)缺少理論支持。因此，本試驗(yàn)通過研究藥桑葉醇提物各萃取部位生物活性，為后續(xù)以生物活性為引導(dǎo)進(jìn)行化合物分離提供活性依據(jù)，最終為綜合開發(fā)利用藥桑葉提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉：2016年7月采自新疆和田地區(qū)，經(jīng)塔里木大學(xué)邱愛軍副教授鑒定為藥桑（Morus nigra L.）植物葉片。藥桑葉片陰干，碾碎備用。

1，1-二苯基-2-芳基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、4-硝基苯基-ɑ-D 吡喃葡萄糖苷（4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶（40 U/mg～80 U/mg）：美國 Sigma 公司；噻唑藍(lán)（thiazoyl blue tetrazolium bromide ，MTT）溶液：賽諾普生物；DMSO 完全培養(yǎng)基：上?？捣€(wěn)生物科技有限公司；胎牛血清：上海哈靈生物科技有限公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）、RMPI-1640 培養(yǎng)基：Gibco 公司；阿卡波糖片：拜耳醫(yī)藥有限公司；維生素C：北京博鰲托大科技有限公司；石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和95%乙醇等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ER-5205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化廠；S54 紫外可見分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；CP224C 電子分析天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司；Infinite M200 Pro 多功能酶標(biāo)儀：北京世貿(mào)遠(yuǎn)東科學(xué)儀器有限公司；TDL-5-A 離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；DZF-6050 真空干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生物活性成分提取

取5 kg 陰干藥桑葉，碾碎，以80%乙醇浸泡72 h，過濾，重復(fù)3 次，收集濾液，減壓濃縮得到1.1 kg 流浸膏。將流浸膏分散至5 L 蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇按照體積比（1 ∶1）進(jìn)行萃取，重復(fù)3次，并濃縮至干，分別得到石油醚相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相。

1.3.2 抗腫瘤活性

采用MTT 測試法[9-10]，測定樣品對Hela 腫瘤細(xì)胞的抑制活性。

1.3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Hela 細(xì)胞株，用含10%胎牛血清RPIM-1640 培養(yǎng)基培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2.2 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)組：將一定量乙酸乙酯相，正丁醇相和水相樣品加入到RPIM-1640 培養(yǎng)液，配置成0.005、0.010、0.050 mg/mL 和0.100 mg/mL 4 個(gè)濃度，取一定量樣品溶液作用于HeLa 細(xì)胞，每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。

陰性對照組：取等量RPIM-1640 培養(yǎng)液，作用于HeLa 細(xì)胞，設(shè) 4 個(gè)復(fù)孔。

空白對照組：取等量無菌水，作用于Hela 細(xì)胞，設(shè)4 個(gè)復(fù)孔。

1.3.2.3 MTT 法檢測

取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×104/mL，接種于96 孔板，每孔加入細(xì)胞懸液0.2 mL。培養(yǎng)16 h后，吸出培養(yǎng)液，加入樣品溶液0.2 mL。4 h 后每孔加入5 g/L MTT 溶液 10μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，每孔加入二甲基亞砜 100 μL，37 ℃振蕩 5 min，用酶標(biāo)儀在 570 nm 波長處測定其OD 值，按下述公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.3.3 抗氧化活性

通過測定DPPH 自由基清除能力[11-12]，研究各萃取相體外抗氧化活性。

1.3.3.1 DPPH 自由基溶液的配置

準(zhǔn)確稱取DPPH 0.019 7 g，加入至250 mL 的容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇定容，所得DPPH 溶液濃度即為0.2 mmol/L，靜止30 min 后，避光保存。

1.3.3.2 樣品液的配置

陽性組：取維生素C 適量，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇配置濃度分別為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的樣品溶液。

試驗(yàn)組：取石油醚相，乙酸乙酯相，正丁醇相，水相適量，用 95%的乙醇配置濃度分別為 0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL 的樣品溶液。

1.3.3.3 測定方法

取樣品溶液和DPPH 自由基溶液各2.0 mL 加入到試管內(nèi)，混勻后，在恒溫（28 ℃）條件下避光反應(yīng)30 min，空白對照為體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，在517 nm處測定吸光度。每個(gè)樣品做3 次平行樣。DPPH 自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中A1為樣品溶液與DPPH 溶液反應(yīng)后的吸光度值；A2為樣品溶液與無水乙醇代替DPPH 溶液反應(yīng)后的吸光度值；A0為無水乙醇與DPPH 反應(yīng)后的吸光度值。

1.3.4 降血糖活性

通過測定體外α-葡萄糖苷酶抑制，評價(jià)各萃取相的降血糖活性。參照王賀等的測定方法[13-14]，測定以對硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物的α-葡萄糖苷酶活性。

1.3.4.1 溶液的配制

底物溶液配制：準(zhǔn)確稱取PNPG 0.038 7g，用PBS緩沖液溶解并定容至100 mL，得2.5 mmol/L 的底物溶液。

α-葡萄糖苷酶溶液配制：準(zhǔn)確量取0.1 mL α-葡萄糖苷酶溶液加至PBS 中，配制成0.72 U/mL 的溶液，避光保存。

樣品溶液配制：取適量樣品溶于一定量的PBS，配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 的樣品溶液。

阿卡波糖溶液配制：取適量阿卡波糖片劑溶于PBS，配制成 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL 溶液。

1.3.4.2 反應(yīng)體系

取 80 μL 的磷酸緩沖液，加入 16 μL 的待測樣品，再加入16 μL 的α-葡萄糖苷酶，搖勻后置于37 ℃的恒溫水浴鍋中，反應(yīng)20 min，然后再加入16 μL 的底物，反應(yīng)終止后加入 100 μL 的 Na2CO3終止液（c=1 mol/L）。在400 nm 處測定在酶作用下的釋放出的對硝基苯的吸光度值，計(jì)算抑制率。酶抑制試驗(yàn)重復(fù)3 次。具體反應(yīng)見表1，計(jì)算公式如下：

式中：AⅠ為空白組吸光度值；AⅡ?yàn)樵囼?yàn)組吸光度值；AⅢ為背景組吸光度值。

表1 α-葡萄糖苷酶活性抑制體系Table 1 α-glucosidase activity inhibition system μL

2 結(jié)果與分析

2.1 抗腫瘤活性

各萃取相對Hela 細(xì)胞的抑制率見表2。

表2 各萃取相對Hela 細(xì)胞的抑制率Table 2 Inhibition of each part against Hela tumor cells

由表2數(shù)據(jù)可知，乙酸乙酯相和正丁醇相在樣品濃度為0.005 mg/mL 時(shí)表現(xiàn)出對Hela 腫瘤細(xì)胞有一定的抑制作用。隨著樣品濃度增加，抑制效果也更加明顯。當(dāng)濃度達(dá)到0.010 mg/mL 時(shí)，乙酸乙酯相抑制率達(dá)到93.75%，正丁醇相抑制率達(dá)到89.41%，抑制效果顯著。當(dāng)乙酸乙酯相的濃度達(dá)到0.050 mg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)到96.54%，這與空白對照組的抑制率接近。說明乙酸乙酯相中存在具有抑制Hela 腫瘤細(xì)胞增殖的優(yōu)良化合物，從而說明乙酸乙酯相具有較高的開發(fā)利用價(jià)值。

水相數(shù)據(jù)表明，在濃度達(dá)到0.005 mg/mL 時(shí)，存在微弱抑制效果，但是當(dāng)濃度達(dá)到0.010 mg/mL 時(shí)，抑制作用減弱，當(dāng)達(dá)到0.050 mg/mL 時(shí)，抑制率達(dá)到-15.56%，說明水相中可能存在促進(jìn)Hela 腫瘤細(xì)胞增殖的化學(xué)物質(zhì)，這與王珊珊等[15]的研究發(fā)現(xiàn)有些藥物可在一定程度上促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖這一現(xiàn)象存在一定程度上吻合。

此外，由于石油醚相在RPIM-1640 培養(yǎng)液中溶解性較差，未對其進(jìn)行抗Hela 腫瘤細(xì)胞的活性試驗(yàn)

2.2 抗氧化活性

各相對DPPH 自由基的清除能力見圖1。

圖1 各相對DPPH 自由基的清除能力Fig.1 Scavenging effects of each part on DPPH

由圖1可知，對各萃取相清除DPPH 自由基能力進(jìn)行比較，乙酸乙酯相清除DPPH 自由基能力較強(qiáng)。在質(zhì)量濃度0.4 mg/mL～2.0 mg/mL 范圍內(nèi)，各相對DPPH自由基的清除能力隨濃度增加而增強(qiáng)。乙酸乙酯相和正丁醇相在低濃度時(shí)表現(xiàn)出良好的DPPH 自由基清除能力，然后隨濃度增加清除率趨于平緩。石油醚相和水相對DPPH 自由基的清除能力相當(dāng)。石油醚相和水相在0.4 mg/mL 時(shí)DPPH 自由基清除能力表現(xiàn)不明顯，但隨著濃度增加，清除自由基能力也增強(qiáng)，當(dāng)二者濃度超過1.6 mg/mL 時(shí)，對DPPH 自由基的清除率趨于平緩。本試驗(yàn)的陽性對照組VC表現(xiàn)出強(qiáng)抗氧化能力，對DPPH 自由基的清除率在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)超過93%，為試驗(yàn)提供良好的對比，從而能夠判斷乙酸乙酯相較其他萃取相具有較強(qiáng)的抗氧化能力。

2.3 降血糖活性

各萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用見圖2。

圖2 各萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibition of α-glucosidase by each part

由圖2數(shù)據(jù)可知，藥桑葉乙醇提取物各萃取相對α-葡萄糖苷酶的抑制活性成劑量依賴性。抑制活性表現(xiàn)為同等濃度下，乙酸乙酯相體外抑制活性最強(qiáng)，正丁醇相優(yōu)于石油醚相和水相。石油醚相和水相對α-葡萄糖苷酶體外抑制活性接近。對所測各萃取相數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合，得阿卡波糖、乙酸乙酯相和正丁醇相對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度，見表3。石油醚相和水相在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對酶的抑制活性低于50%，對其二者的半抑制濃度不作分析。

表3 對α-葡萄糖苷酶的半抑制濃度Table 3 Half inhibiting concentration on α-glucosidase

3 結(jié)論

通過對藥桑葉乙醇提取物各萃取相進(jìn)行3 種活性試驗(yàn)，初步發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯相在3 種活性試驗(yàn)中均表現(xiàn)出較好的活性。說明乙酸乙酯相中具有潛在體外生物活性良好、含量相對較高的活性化學(xué)物質(zhì)。

抗腫瘤試驗(yàn)的結(jié)果表明乙酸乙酯相中具有細(xì)胞毒性較好的化學(xué)物質(zhì)。楊燕[16]通過對桑葉的研究發(fā)現(xiàn)桑葉乙酸乙酯相具有抗腫瘤活性，桑和藥桑同屬桑科桑屬，故推測二者葉中可能存在類似抗腫瘤結(jié)構(gòu)物質(zhì)。同時(shí)，值得注意的是水相中可能存在促進(jìn)Hela 腫瘤細(xì)胞增殖的物質(zhì)。

藥桑葉乙酸乙酯相和正丁醇相抗氧化活性較強(qiáng)，說明二者當(dāng)中存在一些還原性較強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)。張貴會(huì)等[17-19]對藥桑葉中存在的黃酮類物質(zhì)進(jìn)行研究，并從中分離出若干黃酮及其苷類化合物，并對其抗氧化活性進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)抗氧化活性良好。因此推測，藥桑葉乙酸乙酯相和正丁醇可能相富含大量黃酮類化合物，此外，有研究發(fā)現(xiàn)[16，20]，桑葉中含有茋類等一些具有抗氧化活性的化合物。桑葉（Morus alba L.）和藥桑同屬桑科桑屬，進(jìn)而推測藥桑葉中亦可能含有茋類化合物。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，選定乙酸乙酯相進(jìn)行化合物分離純化鑒定，并進(jìn)行后續(xù)活性試驗(yàn)，以期挖掘具有生物活性良好，具有開發(fā)潛力的前體化合物。

綜上所述，藥桑作為我國唯一的黑桑種資源[21]，在維吾爾族傳統(tǒng)醫(yī)藥中發(fā)揮巨大作用。藥桑桑葉產(chǎn)量大，可開發(fā)利用價(jià)值高。在上述生物活性研究基礎(chǔ)上，對藥桑葉進(jìn)一步深入研究，進(jìn)而為綜合開發(fā)利用藥桑葉資源提了供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)。