耿靜，韓秋霞，高文靜，肖麗嬌

(山東科技大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山東 青島 266590)

生存于曬鹽場(chǎng)、鹽湖和鹽礦中的嗜鹽微生物，種類豐富，在產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎且生物活性優(yōu)質(zhì)的天然化合物方面，因其所處的高滲透壓、缺氧等特殊的環(huán)境，具有得天獨(dú)厚的生理?xiàng)l件[1-3]。近年來(lái)的研究表明，嗜鹽微生物能夠分泌可以適應(yīng)于高鹽環(huán)境的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纖維素酶等的代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物大多具有耐有機(jī)溶劑和耐鹽的特性，因此能夠在高鹽或低水活度條件下維持高活性和穩(wěn)定性[4]。在龐大的嗜鹽微生物群體中，中度嗜鹽菌作為極端微生物的一個(gè)重要的類群，不斷地被分離鑒定，研究發(fā)現(xiàn)其能夠在0.5～1.5 mol/L鹽度中擁有最佳生長(zhǎng)能力[5，6]。通過深入的研究，發(fā)現(xiàn)中度嗜鹽菌能抵抗外界高濃度的鹽環(huán)境，并能應(yīng)對(duì)鹽度大范圍的波動(dòng)，因此，與極端嗜鹽菌相比，中度嗜鹽菌有分布廣泛、營(yíng)養(yǎng)要求較低、易于適應(yīng)環(huán)境、工業(yè)應(yīng)用價(jià)值高的優(yōu)勢(shì)[7，8]。蛋白酶在生命過程中承擔(dān)著重要的功能，也是一種重要的工業(yè)酶制劑，目前廣泛應(yīng)用于洗滌劑、食品、醫(yī)藥、制革、紡織及廢物處理等領(lǐng)域。然而，在高鹽或低水活度條件下，普通的蛋白酶會(huì)變性失活，因此，其在高鹽發(fā)酵食品或高鹽污水處理等特殊領(lǐng)域的應(yīng)用也受到了限制[9-11]。而嗜鹽菌所分泌的蛋白酶，因其特殊的性質(zhì)，為其在特殊領(lǐng)域如高鹽發(fā)酵工業(yè)、洗滌和污水處理行業(yè)等的應(yīng)用提供了天然保障，拓寬了普通蛋白酶的催化和應(yīng)用范圍，在生物技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)有巨大的應(yīng)用價(jià)值。

相較于資源龐大的嗜鹽菌菌群，對(duì)嗜鹽菌蛋白酶資源的研究與利用還處于起步階段[12-14]。本研究取樣自山東濰坊昌邑某曬鹽場(chǎng)鹽濃度為21%的海鹽水中，通過初步的分離純化、生理生化鑒定以及分子生物學(xué)鑒定得到目標(biāo)菌株Salinivibriosp. MK070917；進(jìn)一步對(duì)菌株的生長(zhǎng)過程和產(chǎn)酶特性進(jìn)行探究，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的探究。

1 材料和方法

1.1 菌株樣品來(lái)源

樣品為昌邑某鹽場(chǎng)濃度為21%海鹽水水平面下15 cm處水樣，4 ℃暫存。帶回后稀釋水樣并涂布，分離純化后，斜面保藏至冰箱。

1.2 試劑和培養(yǎng)基

1.2.1 主要試劑

干酪素、福林酚試劑、三氯乙酸、碳酸鈉、L-酪氨酸。

1.2.2 培養(yǎng)基

Gibbons液體培養(yǎng)基(GM，g/L)：酪素水解物5 g，酵母浸出物10 g，蛋白胨5 g，檸檬酸鈉3 g，MgSO4·7H2O 20 g，KCl 2 g，NaCl 100 g。固體GM：添加2%的瓊脂。

篩選培養(yǎng)基：固體GM中添加1%脫脂奶粉。

1.3 福林酚法測(cè)定蛋白酶酶活

按中華人民共和國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317-1999《蛋白酶活力測(cè)定法》，采用福林酚法，測(cè)定蛋白酶酶活[15]。

酶活定義：在一定溫度和pH值條件下，1 mL液體粗酶1 min水解酪素產(chǎn)生1 μg酪氨酸作為1個(gè)酶活單位，用U來(lái)表示。

1.4 產(chǎn)蛋白酶菌株的篩選

1.4.1 菌株的初篩

純化后的菌株點(diǎn)種于篩選培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明水解圈。

1.4.2 菌株的復(fù)篩

1.4.2.1 粗酶液的制備

純化后的菌株按2%(W/V)的比例接種至液體GM中，培養(yǎng)至72 h的菌液在8000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，取上清液進(jìn)行測(cè)試。

1.4.2.2 菌株的復(fù)篩(平板擴(kuò)散法)

脫脂牛奶-鹽-瓊脂擴(kuò)散平板法：制作牛奶-鹽-瓊脂固體平板并放置牛津小杯，做標(biāo)記；以空白GM做對(duì)照，未離心的菌液作為實(shí)驗(yàn)組1，粗酶液作為實(shí)驗(yàn)組2，分別加入到牛津小杯中，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，放置12 h，觀察。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

活化后的菌株委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序。

序列采用MEGA 7.0軟件中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.6 菌株生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用

1.6.1 菌株生長(zhǎng)條件

NaCl濃度設(shè)置為0%、5%、10%、15%、20%、25%；pH梯度為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0；溫度梯度為25，30，25，40 ℃；金屬離子添加為Fe3+、Co2+、Ni2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+，終濃度為5 mmol/L。活化后的菌株按2%(W/V)的比例接種后于200 r/min震蕩培養(yǎng)72 h；每隔4 h取樣1次，制備粗酶液，測(cè)定蛋白酶酶活。

1.6.2 營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用

以葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、糊精、麥芽糖和甘露醇為唯一碳源添加到GM中；以蛋白胨、脫脂牛奶、明膠、牛肉浸粉、胰蛋白胨、酪蛋白、酵母浸粉、酪素水解物、氯化銨、亞硝酸鈉和硝酸銨為唯一氮源添加到GM中，分別按2%(W/V)的比例接種，于200 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，制備粗酶液，測(cè)定蛋白酶酶活。

1.7 單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)

對(duì)培養(yǎng)基的各組成部分進(jìn)行產(chǎn)酶的單因素試驗(yàn)探索，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別設(shè)置4個(gè)因素的最陡爬坡試驗(yàn)，按照不同因素、不同水平的設(shè)置配制培養(yǎng)基，活化后的菌株按2%的比例接種，于200 r/min震蕩培養(yǎng)72 h，制備粗酶液，測(cè)定蛋白酶酶活。單因素試驗(yàn)設(shè)置分別為：碳源梯度0%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%；氮源梯度0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%；KCl添加終濃度0.5‰、1‰、1.5‰、2‰、2.5‰、3‰；檸檬酸鈉添加終濃度1‰、2‰、3‰、4‰、5‰、6‰。

1.8 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株產(chǎn)酶條件

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果以及Box-Behnken設(shè)計(jì)原則，4個(gè)因素分別以A(糊精)、B(蛋白胨)、C(KCl)和D(檸檬酸鈉)表示，以單因素試驗(yàn)結(jié)果的最佳條件作為中水平，即0水平，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平表見表1。

表1 菌株培養(yǎng)條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for optimization of strain culture conditions

1.9 數(shù)據(jù)分析

生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶特性試驗(yàn)分別設(shè)置3組平行樣品，按照時(shí)間間隔分別取樣測(cè)定蛋白酶的酶活，取平均值，并繪制生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶曲線；營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用試驗(yàn)、單因素試驗(yàn)以及最陡爬坡試驗(yàn)測(cè)定3次，用SPSS 18.0進(jìn)行顯著性分析，顯著水平(P<0.05)；響應(yīng)面結(jié)果根據(jù)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選

菌株MK070917在初篩平板上產(chǎn)生透明水解圈，說(shuō)明其具有產(chǎn)蛋白酶的能力，結(jié)果見圖1。復(fù)篩圖結(jié)果顯示，空白培養(yǎng)基的存在并不能讓篩選培養(yǎng)基產(chǎn)生透明水解圈，因此排除了空白培養(yǎng)基所帶來(lái)的誤差；而未離心的菌液和離心后的上清液均可以讓篩選培養(yǎng)基產(chǎn)生直徑大致相同的透明水解圈，證明菌株所產(chǎn)的蛋白酶為胞外蛋白酶。

圖1 菌株MK070917初篩和復(fù)篩結(jié)果Fig.1 Screening and rescreening results of strain MK070917

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

經(jīng)生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序后，返回的測(cè)序結(jié)果提交GenBank，并利用MAGE 7.0軟件中的鄰接法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，結(jié)果見圖2。MK070917菌株與Salinivibrio屬內(nèi)SalinivibriocosticolaS6的同源性為99%，系統(tǒng)發(fā)育分析歸為同種，結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化特征, 確定其為Salinivibrio屬成員, 命名為Salinivibriosp. MK070917菌株。

圖2 菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.2 Phylogenetic analysis of strain based on 16S rDNA sequence

2.3 菌株生長(zhǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用

圖3 菌株的生長(zhǎng)特性和產(chǎn)酶特性Fig.3 Growth characteristics and enzyme production characteristics of the strain

菌株的生長(zhǎng)條件測(cè)定見圖3。菌株可以在5%～15%的NaCl濃度范圍內(nèi)生長(zhǎng)并產(chǎn)蛋白酶，由圖3A可知，NaCl濃度為10%時(shí)，該菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶能力最大，因此，判斷該菌株為中度嗜鹽菌，并選擇10%的NaCl濃度進(jìn)行下一步生長(zhǎng)條件的探索。由圖3B可知，pH 6.0～9.0之間菌株均可以生長(zhǎng)并產(chǎn)蛋白酶，pH為5.0和10.0時(shí)，菌株無(wú)法生長(zhǎng)。pH為7.0時(shí)，其產(chǎn)酶的酶活均高于其他pH條件，因此選擇pH 7.0為產(chǎn)酶的最適pH。由圖3C可知，菌株于25～40 ℃之間可以生長(zhǎng)和產(chǎn)蛋白酶。當(dāng)溫度為30 ℃時(shí)，其產(chǎn)酶能力最強(qiáng)，因此選擇30 ℃為產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)溫度。由圖3D可知金屬離子的添加對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響，F(xiàn)e3+、Ni2+、Ca2+、Mn2+和Co2+的添加沒有抑制菌株的產(chǎn)酶，但是其產(chǎn)酶開始的時(shí)間為42 h左右，說(shuō)明上述金屬離子的存在對(duì)于菌體前期的產(chǎn)酶具有一定的抑制作用，Cu2+和Zn2+的存在使得菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)，但是所有添加金屬離子的菌株的產(chǎn)酶能力相較于未添加金屬離子的原液都差。

菌株Salinivibriosp. MK070917可以利用多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)作為碳源和氮源，這與已報(bào)道的嗜鹽菌產(chǎn)蛋白酶的特點(diǎn)相吻合。由圖4A可知，糊精作為碳源添加時(shí)，比原培養(yǎng)基中碳源酵母浸出物增加了0.25倍，也就是酶活增加了25%(P<0.05)，增加顯著，但是甘露醇的添加使得菌株無(wú)法正常生長(zhǎng)。由圖4B可知，蛋白胨作為氮源添加時(shí)，菌株所產(chǎn)蛋白酶表現(xiàn)出來(lái)的活性最高，其他氮源的添加并沒有顯著的提高菌株產(chǎn)蛋白酶的能力，明膠和亞硝酸鈉的添加甚至不能使菌株進(jìn)行正常生長(zhǎng)。胰蛋白胨作為氮源添加時(shí)，是除蛋白胨作為氮源酶活最高的氮源添加，但是胰蛋白胨的添加使得蛋白酶的酶活顯著下降了33.3%(P<0.05)。因此選用麥芽糊精作為碳源替代GM中的酵母浸出物，氮源物質(zhì)仍為原來(lái)的蛋白胨。

圖4 菌株Salinivibrio sp. MK070917對(duì)碳源和氮源的利用Fig.4 Utilization of carbon sources and nitrogen sources by strain Salinivibrio sp. MK070917

2.4 單因素試驗(yàn)和最陡爬坡試驗(yàn)

針對(duì)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)中對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶影響最顯著的4個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，分別于各因素各水平條件下接種，培養(yǎng)72 h，測(cè)定粗酶液酶活，見圖5，依次為糊精(A)、蛋白胨(B)、KCl(C)和檸檬酸鈉(D)。糊精添加量1%時(shí)，酶活達(dá)到最大，糊精添加量為2%時(shí)，高濃度的糊精抑制了菌株的正常生長(zhǎng)，產(chǎn)酶能力幾乎為0，糊精添加量為1.25%和0.75%時(shí)，酶活變化顯著；蛋白胨作為最優(yōu)氮源，其最佳的添加量為1%，蛋白胨添加量為0.75%時(shí)，酶活變化顯著，而蛋白胨添加量為1.5%時(shí)，酶活變化不顯著；KCl的最佳添加量為1‰，KCl添加量為0.5‰和1.5‰時(shí)，酶活變化顯著；而檸檬酸鈉的最佳添加量為2‰，此處為酶活最大值點(diǎn)，檸檬酸鈉為1‰和3‰時(shí)，酶活變化并不顯著。然而最優(yōu)發(fā)酵條件并不一定是各個(gè)單因素所得最佳條件的簡(jiǎn)單組合，需要在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)確定最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)條件。響應(yīng)面試驗(yàn)各因素水平的選擇為：糊精添加量0.75%～1.25%，蛋白胨添加量0.75%～1.5%，KCl添加量為0.5‰～1.5‰，檸檬酸鈉為1%～3%；蛋白酶酶活作為響應(yīng)值。

圖5 產(chǎn)酶條件單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Single factor test results of enzymeproduction conditions

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化產(chǎn)酶條件

以糊精(A)、蛋白胨(B)、KCl(C)和檸檬酸鈉(D)為試驗(yàn)因素，以蛋白酶酶活為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按照二次項(xiàng)回歸方程進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 Box-Benhken試驗(yàn)方案與結(jié)果Table 2 Design and result of Box-Benhken experiment

根據(jù)表2的試驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)面軟件處理后確定回歸方程：酶活(U)=29.32-2.08A+0.58B+0.34C-1.83AB-1.33AC-0.38AD+0.63CD-2.45A2-2.00B2-1.85C2-1.96D2。

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，回歸模型的方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析和顯著性檢測(cè)Table 3 Variance analysis and significance detection of regression model

續(xù) 表

注：“***”為極顯著，“**”為較顯著，“*”為顯著。

由表3可知，本試驗(yàn)所得模型的P值為0.0076，說(shuō)明模型極顯著(P<0.01)；模型失擬項(xiàng)的P值為0.3728，說(shuō)明模型失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05)。一次項(xiàng)A和二次項(xiàng)A2、B2、D2對(duì)模型的影響極顯著(P<0.01)；二次項(xiàng)C2對(duì)菌株產(chǎn)蛋白酶的影響顯著(P<0.05)。兩因子試驗(yàn)，糊精和蛋白胨、KCl和糊精之間的交互作用顯著(P<0.05)。

圖6 響應(yīng)面設(shè)計(jì)兩因子交互作用曲面圖Fig.6 Surface diagrams of two-factor interaction in response surface design

根據(jù)軟件所做的響應(yīng)曲面圖見圖5，以蛋白酶的酶活為響應(yīng)值，糊精和蛋白胨的交互作用見圖6A，糊精和KCl濃度間的交互作用見圖6B，這2個(gè)曲面圖形的頂點(diǎn)落在中心位置左右，區(qū)域俯視圖趨近于橢圓形，說(shuō)明交互作用顯著；檸檬酸鈉和KCl濃度間的交互作用見圖6F，蛋白胨和檸檬酸鈉之間的交互作用見圖6E，蛋白胨和KCl濃度間的交互作用見圖6D，3個(gè)曲面圖形的曲線比較平穩(wěn)，區(qū)域俯視圖趨近于圓形，說(shuō)明交互作用不顯著；糊精和檸檬酸鈉濃度間的交互作用見圖6C，曲面圖形的曲線較陡，區(qū)域俯視圖形也趨近于橢圓形，然而橢圓形區(qū)域并無(wú)實(shí)線，說(shuō)明交互作用并沒有體現(xiàn)在此模型中。

通過Design-Expert 8.0.5b軟件進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化，最優(yōu)培養(yǎng)條件為：以Gibbons培養(yǎng)基為基底，NaCl濃度為10%，pH為7.0，培養(yǎng)溫度為30 ℃，碳源為糊精，含量為0.66%；氮源為蛋白胨，含量為1.11%；KCl的含量為1.16‰；檸檬酸鈉的含量為2.10‰；根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果得出的最優(yōu)方案對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行配制，以此檢驗(yàn)響應(yīng)面法所得結(jié)果的可行性，經(jīng)過3次重復(fù)性試驗(yàn)，最終蛋白酶酶活可到30.192 U，與預(yù)期值30.12 U相比，其差異為0.5%，結(jié)果表明該模型合理可靠，所優(yōu)化的最佳培養(yǎng)條件能夠被用于蛋白酶的高效產(chǎn)酶培養(yǎng)。

自鹽濃度21%的曬鹽場(chǎng)海鹽水中分離得到1株Salinivibrio屬的中度嗜鹽菌Salinivibriosp. MK070917，在適宜培養(yǎng)條件下可產(chǎn)胞外蛋白酶。

以Gibbons培養(yǎng)基為基底，對(duì)該菌株進(jìn)行分離純化后，進(jìn)行菌株產(chǎn)蛋白酶的篩選，在篩選培養(yǎng)基上產(chǎn)生較大的透明水解圈，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的產(chǎn)蛋白酶能力；進(jìn)一步對(duì)菌株的生長(zhǎng)特性和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用進(jìn)行探究，得知菌株可以生長(zhǎng)并產(chǎn)酶于NaCl濃度為5%～10%、pH為6.0～9.0、溫度為25～45 ℃的條件下，并可以利用葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖、酵母浸出物、糊精和麥芽糖為碳源，利用蛋白胨、脫脂牛奶、牛肉浸粉、酪素水解物、胰蛋白胨、酵母浸粉、酪蛋白、氯化銨和硝酸銨為氮源；并利用單因素法結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化了該菌株產(chǎn)胞外蛋白酶的最適培養(yǎng)條件：碳源為糊精，含量為0.66%；氮源為蛋白胨，含量為1.11%，KCl的含量為1.16‰，檸檬酸鈉的含量為2.10‰。經(jīng)響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最高產(chǎn)酶量為30.192 U，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)酶量為30.18 U，與理論值相比差異為0.5%。

3 結(jié)論

本文所研究的可產(chǎn)蛋白酶的中度嗜鹽菌菌株Salinivibriosp. MK070917經(jīng)過優(yōu)化之后，其蛋白酶的酶活顯著提高，侯靖等人對(duì)嗜鹽菌株Halorussussp. XZYJ18產(chǎn)胞外蛋白酶的研究和高瑞昌等人對(duì)嗜鹽古菌Halobacteriaceaesp.產(chǎn)胞外蛋白酶的研究以及趙夢(mèng)琴對(duì)1株嗜鹽古菌產(chǎn)胞外蛋白酶的研究，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Salinivibriosp. MK070917所產(chǎn)的胞外蛋白酶粗酶，在相同的測(cè)定條件下，酶活要更高一點(diǎn)，開始產(chǎn)酶的時(shí)間也要更早一點(diǎn)；Mohammad Ali Amoozegar等人對(duì)Salinivibriosp. AF-2004產(chǎn)胞外蛋白酶的優(yōu)化，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，作為同Salinivibrio屬的MK070917，其生長(zhǎng)條件除pH外基本一致，產(chǎn)酶開始的時(shí)間和產(chǎn)酶趨勢(shì)也相一致，但MK070917所產(chǎn)的胞外蛋白酶的酶活更高一點(diǎn)，產(chǎn)酶條件也更溫和；Dian Siti S等人對(duì)中度嗜鹽菌PseudomonasstutzeriBK AB-12所產(chǎn)胞外蛋白酶的研究，對(duì)比發(fā)現(xiàn)，Salinivibriosp. MK070917在產(chǎn)酶穩(wěn)定性上要更高。此外，菌株所產(chǎn)的胞外蛋白酶可以生長(zhǎng)于各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和含金屬離子的環(huán)境中，因此，其對(duì)于富含有機(jī)質(zhì)和金屬離子的高鹽廢水的處理具有現(xiàn)實(shí)意義和廣泛的應(yīng)用價(jià)值。菌株優(yōu)化得到的發(fā)酵條件較為溫和，使得其在工業(yè)生產(chǎn)中更利于大規(guī)模的操作，實(shí)現(xiàn)批量生產(chǎn)，節(jié)能環(huán)保；優(yōu)化所得碳源為糊精，糊精價(jià)格更便宜，而且流動(dòng)性好，便于實(shí)現(xiàn)微生物生產(chǎn)中的恒化培養(yǎng)，其他成分的優(yōu)化，極大地降低了培養(yǎng)基的成本，實(shí)現(xiàn)了培養(yǎng)基的最大化利用。