齊小慧，孫軍勇，謝廣發(fā)，陸健*

1(工業(yè)生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122) 4 (浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州，310015)

黃酒是我國最古老的酒種，擁有數千年的發(fā)展歷史；近年來，由于黃酒的發(fā)展，瓶裝黃酒的渾濁問題受到了行業(yè)內的重視[1]。瓶裝黃酒渾濁現象嚴重影響銷售，在一定程度上制約著黃酒的發(fā)展。黃酒中的蛋白不僅影響黃酒的營養(yǎng)價值[2-3]，而且對渾濁的產生更有顯著的影響[4]。研究發(fā)現[5-6]，蛋白質是引起黃酒渾濁的主要原因，但渾濁的形成與黃酒中蛋白質總量沒有直接關系，而是與某些特定蛋白質有關，找出這些特定蛋白并將其除去，可以大大提高黃酒的非生物穩(wěn)定性，但是特定蛋白質尚不明確。

目前黃酒釀造過程中蛋白質的研究主要集中在對麥曲、發(fā)酵液以及渾濁中的蛋白[7-11]，瓶裝黃酒中蛋白質種類與來源的研究目前未涉及。一些研究者推測[12]，成品黃酒中的蛋白質來源豐富，除了小麥和大米蛋白質外，可能還含有少量的微生物蛋白和酶蛋白，但這一結果并沒有得到試驗驗證。通過對比瓶裝黃酒中蛋白與其他釀造階段的蛋白種類與數量的差異，可以找到引起渾濁的關鍵蛋白。

黃酒的成分較為復雜，除了蛋白質以外，還有多酚、糊精、還原糖、鐵離子等多種成分[5]，這些成分的存在增加了黃酒蛋白分離和鑒定的難度，因此找到合適的瓶裝黃酒蛋白分離方法尤為重要。本文采用0.1 mol/L的乙酸銨-甲醇沉淀黃酒中的蛋白，結合雙向電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)和基質輔助激光解析電離飛行時間串聯質譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)對瓶裝黃酒中的蛋白進行分析，并純化其中主要的蛋白——α-淀粉酶抑制劑0.19，以期對控制瓶裝黃酒的蛋白質渾濁程度提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

500 mL瓶裝黃酒(古越龍山陳5年)，購于無錫當地超市；丙烯酰胺/雙丙烯酰胺(29∶1、30%(W/V))、過硫酸銨(APS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、巰基乙醇、透析膜(3.5 k)、四甲基乙二胺(TEMED)和(NH4)2SO4，購于上海生工生物工程公司；尿素、二硫蘇糖醇(DTT)和3-[(3-膽固醇氨丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)，購于美國Bio-Rad公司；IPG緩沖液和碘乙酰胺(IAA)，購于美國GE公司；α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)、碳酸氫銨、三氟乙酸(TFA)、胰蛋白酶和乙腈，購于Sigma公司；乙醇、丙酮、甲醇、乙酸銨、乙酸、CaCl2、NaCl、溴酚藍、考馬斯亮藍G-250、甘氨酸和聚乙二醇20000，購于國藥化學試劑有限公司；DEAE-Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-100，購于美國GE公司。

1.2 儀器與設備

高速離心機，德國Eppendorf股份公司；Science-10N冷凍干燥機，寧波新藝超聲設備有限公司；UV-2100紫外-可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；PE20精密pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；Mini-Protein 3 Cell蛋白電泳系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司；Ultraflextreme串聯飛行時間質譜儀，德國Bruker公司；蛋白純化系統(tǒng)，美國GE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 瓶裝黃酒蛋白組成分析

(1)雙向電泳

用5倍體積的0.1 mol/L的乙酸銨-甲醇溶液沉淀黃酒中蛋白，將沉淀物用-20 ℃預冷的甲醇洗1次，-20 ℃預冷的丙酮洗2次，并于室溫下干燥15 min左右，使丙酮完全揮發(fā)，最后溶于上樣緩沖液(8 mol/L尿素、0.5% (W/V) CHAPS、0.00 2%溴酚藍、0.2%(W/V)DTT和0.5% IPG buffer)中。

雙向電泳按照文獻[13]的方法修改后進行。采用分離膠濃度為12.5%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide electrophoresis, SDS-PAGE)進行第二向電泳，蛋白膠經固定、染色并脫色至背景清晰備用。

(2)MALDI-TOF-MS分析

質譜鑒定參照文獻[14]的方法進行。

1.3.2 α-淀粉酶抑制劑的純化

(1)不同飽和度(NH4)2SO4沉淀α-淀粉酶抑制劑

向瓶裝黃酒樣品中添加CaCl2至質量濃度為2 g/L，并用40%的NaOH溶液調節(jié)pH至8.0，4 ℃靜置過夜，8 000 r/min離心15 min，上清液置于截留分子質量為3.5 kDa的透析袋中透析72 h，然后用聚乙二醇20 000包埋濃縮[15]。向濃縮后的蛋白溶液中緩慢添加粉末(NH4)2SO4至飽和度為20%，緩慢攪拌至溶液出現渾濁時，靜置1 h以上，8 000 r/min離心15 min，得到的蛋白沉淀記為S1(～20%)(Sediment，沉淀物)；向上清中繼續(xù)添加(NH4)2SO4至30%飽和度，得到的蛋白沉淀記為S2(20%～30%)；重復上述操作，分別得到S3(30%～40%)、S4(40%～50%)、S5(50%～60%)、S6(60%～70%)、S7(70%～80%)和S8(80%～90%)。將這些蛋白組分用去離子水溶解，透析72 h并凍干[16]。

(2)DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱

流動相為pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液，流速為2 mL/min，以含0～1.0 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液進行梯度洗脫，收集蛋白流出液(3 min/管)，逐管檢測蛋白濃度，分別收集各蛋白峰，透析、凍干后用SDS-PAGE進行檢測。

(3)Sephacryl S-100凝膠柱層析

流動相為pH 8.0的0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液，流速為0.5 mL/min，收集蛋白流出液(3 min/管)，逐管檢測蛋白濃度，分別收集各蛋白峰，透析、凍干后用SDS-PAGE檢測。

(4)SDS-PAGE

采用分離膠為12.5%，濃縮膠為4%的SDS-PAGE進行蛋白電泳，上樣量為20 μL(含20 μg蛋白)，開始電壓為60 V，待蛋白條帶跑出濃縮膠后改為80 V，電泳結束后，蛋白膠經固定、染色并脫色至背景清晰備用。

2 結果與分析

2.1 瓶裝黃酒蛋白質組成的2-DE分析

本文采用0.1 mol/L的乙酸銨-甲醇溶液沉淀黃酒中蛋白，乙酸銨-甲醇常用于植物蛋白的分離提取，并且該方法在含有大量干擾物質的樣品中能很好地沉淀出蛋白質[17]。

圖1 瓶裝黃酒蛋白雙向電泳

Fig.1 Two-dimensional electrophoresis protein profile of bottled Chinese rice wine

對圖1中的25個肉眼可見的蛋白點進行鑒定，其中有19個蛋白點鑒定成功，結果列于表1中。從表1的結果可知，瓶裝紹興黃酒中的蛋白包括，來源于小麥的α-淀粉酶抑制劑、類燕麥蛋白、病程相關蛋白，以及來源于大米種子的過敏蛋白RAG2和α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑RA16。從鑒定結果可知，紹興瓶裝黃酒中蛋白質的種類較少且不含微生物蛋白，該結果與瓶裝葡萄酒中蛋白的研究結果類似[18]：葡萄酒中蛋白質均來源于原料葡萄，包括3種不同蛋白。從表1還可以看出，瓶裝黃酒中來源于小麥的蛋白點有16個，其中10個被鑒定為α-淀粉酶抑制劑，在圖中用粗箭頭()標出。其他學者研究發(fā)現，α-淀粉酶抑制劑同時也是導致黃酒渾濁的主要原因[10-11]，由此可知α-淀粉酶抑制劑對黃酒渾濁形成具有較大的影響。

小麥中含有較多的蛋白，在制曲過程中會發(fā)生不同程度的降解[19]。張波[9]認為制曲結束后麥曲中的蛋白主要是微生物分泌的酶蛋白，原料蛋白基本被降解；而孔玲瓊[7]的研究結果表明，麥曲中只有11個蛋白點來源于微生物，113個蛋白點來源于植物蛋白(主要來源于小麥，其中包括43種蛋白)。瓶裝黃酒中蛋白質的研究結果表明，麥曲中的微生物蛋白和大部分的原料蛋白并沒有保留到成品酒中，只有α-淀粉酶抑制劑、類燕麥蛋白和病程相關蛋白被保留下來。王文蒙[20]研究表明，小麥中的α-淀粉酶抑制劑具有很高熱穩(wěn)定性和酸堿耐受性，在80 ℃、pH 3～10的條件下，活性基本不受影響。另外對α-淀粉酶抑制劑的二級結構研究發(fā)現，其每個單體中含有10個半胱氨酸殘基，構成5個二硫鍵，二硫鍵的形成使得α-淀粉酶抑制劑結構較穩(wěn)定[21]，這可能是小麥α-淀粉酶抑制劑經過制曲和發(fā)酵過程后仍能大量殘留于瓶裝黃酒中的原因。

表1 瓶裝黃酒蛋白質譜鑒定結果(7 cm，pH 3～10，NL)

由于α-淀粉酶抑制劑也大量存在于黃酒渾濁物中[10-11]，說明該蛋白在瓶裝黃酒包裝后逐漸變得不穩(wěn)定從而酒液中析出。有研究表明，渾濁產生受多種因素的影響[22]，例如溶液的pH值和離子強度等[23]，這些因素共同作用導致α-淀粉酶抑制劑的三級結構發(fā)生改變，進而使疏水基團暴露導致沉淀析出[23]。

2.2 α-淀粉酶抑制劑的分離純化

瓶裝酒中α-淀粉酶抑制劑的分離純化，對于后續(xù)對其結構進行研究，找到特異性水解該蛋白的蛋白酶，提高黃酒的穩(wěn)定性等，拓寬黃酒渾濁相關的研究均有重要意義。

2.2.1 不同飽和度(NH4)2SO4沉淀效果分析

為了保留α-淀粉酶抑制劑的活性，對其純化時采用(NH4)2SO4進行蛋白的初步提取。由于黃酒成分較為復雜，使用(NH4)2SO4沉淀蛋白時，當添加至60%飽和度，渾濁物質逐漸析出，且酒液逐漸澄清，至70%左右飽和度時(NH4)2SO4不再溶解。因此，在用(NH4)2SO4沉淀蛋白之前，用1.3.2中添加CaCl2的方法處理黃酒樣品，以除去其中的多糖物質。

用不同飽和度的(NH4)2SO4(20%～90%)沉淀處理后的黃酒樣品，得到的沉淀經透析除鹽后用于SDS-PAGE分析，結果如圖2所示。對圖2中的9條蛋白帶進行質譜鑒定，結果見表2。除了條帶1和5，其余6個蛋白條帶均鑒定為α-淀粉酶抑制劑。因此，選用30%～90%飽和度的(NH4)2SO4進行蛋白的粗提取。

圖2 不同飽和度硫酸銨沉淀蛋白的SDS-PAGE

Fig.2 SDS-PAGE of proteins precipitated by ammonium sulfate with different saturation

注：泳道1代表S1(～20%)；泳道2代表S2(20%～30%)；泳道3代表S3(30%～40%)；泳道4代表S4(40%～50%)； 泳道5代表S5(50%～60%)；泳道6代表S6(60%～70%)；泳道7代表S7(70%～80%)；泳道8代表S8(80%～90%)。

表2 不同飽和度硫酸銨沉淀蛋白的質譜鑒定 (7 cm，pH 3～10，NL)

Table 2 Identified proteins precipitated by ammonium sulfate with different saturation by MALDI-TOF/TOF MS

蛋白點蛋白名稱登錄號理論等電點理論分子質量/kDa來源Mascot分數2α-淀粉酶抑制劑0.19gi|1239636.6613.3小麥443α-淀粉酶抑制劑0.19gi|1239636.6613.3小麥574α-淀粉酶抑制劑0.19gi|1239636.6613.3小麥536α-淀粉酶抑制劑0.19gi|1239636.6613.3小麥537α-淀粉酶抑制劑0.19gi|1239636.6613.3小麥68

2.2.2 α-淀粉酶抑制劑的純化

由于α-淀粉酶抑制劑0.19理論等電點為6.66，因此選用pH為8.0的Tris-HCl緩沖液為流動相，在該體系中，α-淀粉酶抑制劑0.19帶負電荷，能與帶正電荷的填料相結合。黃酒α-淀粉酶抑制劑經DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱純化結果見圖3。

從圖3可知道，經DEAE-sepharose fast flow弱陰離子交換柱純化之后，得到3個蛋白峰，1個穿透峰(峰1)，2個洗脫峰(峰2、峰3)。其中峰1所含蛋白為不帶電或者帶正電的蛋白，這2種蛋白沒有與帶正電荷的填料結合直接被洗脫下，因此不含有α-淀粉酶抑制劑0.19。將峰2和峰3分別收集，脫鹽后對2個洗脫峰進行SDS-PAGE檢測，結果如圖4所示。

圖3 α-淀粉酶抑制劑DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱

Fig.3 DEAE-Sepharose Fast Flow of alpha-amylase inhibitor

從圖4可以看出，峰2、峰3中均含有α-淀粉酶抑制劑0.19，將峰2與峰3凍干后稱重，分別為0.5和7.8 g，由此可知目的蛋白α-淀粉酶抑制劑0.19主要存在于第3個蛋白峰中。由于經DEAE-sepharose fast flow弱陰離子交換柱純化之后仍含有雜蛋白，因此需要進一步純化。

圖4 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱純化后蛋白的SDS-PAGE檢測

Fig.4 SDS-PAGE of protein after separated by DEAE-Sepharose Fast Flow

注：泳道1代表峰2；泳道2代表峰3。

經DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱純化后得到的洗脫峰3，再用Sephacryl S-100凝膠柱進一步純化。圖5-a所示為該峰蛋白的Sephacryl S-100葡聚糖凝膠層析，峰3中的蛋白經Sephacryl S-100葡聚糖凝膠層析之后，得到1個蛋白峰，但有明顯的拖尾現象，說明該峰的蛋白中含有一些雜蛋白。收集該峰1～21管蛋白樣品，冷凍干燥后再次用Sephacryl S-100凝膠柱純化，結果如圖5-b所示；再次純化得到1個對稱的蛋白峰，說明該峰含有一個蛋白組分。對純化后的蛋白進行SDS-PAGE檢測，結果如圖6所示。

a-第一次Sephacryl S-100凝膠柱純化;b-第二次SephacrylS-100凝膠柱純化

圖5 α-淀粉酶抑制劑的Sephacryl S-100葡聚糖凝膠層析

Fig.5 Seperation of α-amylase inhibitor on Sephacryl S-100

圖6 Sephacryl S-100葡聚糖凝膠柱純化后蛋白的SDS-PAGE檢測

Fig.6 SDS-PAGE of protein purified by Sephacryl S-100

從圖6可以看出，瓶裝紹興黃酒中的蛋白經(NH4)2SO4沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow弱陰離子交換柱及2次Sephacryl S-100凝膠柱層析純化，得到電泳純的α-淀粉酶抑制劑，經軟件(Image Lab)計算分子質量為13.7 kDa。

小麥中的α-淀粉酶抑制劑有3種存在形式[25]，分別是分子質量為12 kDa的單體、24 kDa的二聚體和64 kDa的四聚體，α-淀粉酶抑制劑的二聚體和四聚體均可裂解為分子質量約為13.3 kDa的單體，這與本試驗中純化得到的蛋白分子質量基本一致。分子質量為24 kDa的二聚體根據不同的電泳遷移率又可分為0.19、0.36、0.38和0.35等不同型號[24]，因此，本研究中的α-淀粉酶抑制劑0.19屬于二聚體的一種。研究發(fā)現小麥中不同分子質量的α-淀粉酶抑制劑的抑制活性與熱穩(wěn)定性不同，分子質量為12 kDa的單體僅能抑制昆蟲淀粉酶的活性，而二聚體和四聚體形式的α-淀粉酶抑制劑對大多數哺乳動物中的淀粉酶都有很好的抑制作用[20]；二聚-α-淀粉酶抑制劑在溫度低于80 ℃時活性幾乎不受影響，而四聚體α-淀粉酶抑制劑在溫度低于60 ℃時活性保持穩(wěn)定[20,25]。

3 結論

瓶裝紹興黃酒中的蛋白組成包括來源于小麥的α-淀粉酶抑制劑0.19、類燕麥蛋白(類燕麥蛋白b3、類燕麥蛋白b8、類燕麥蛋白b10)和病程相關蛋白，以及來源于大米種子的過敏蛋白RAG2和α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制劑RA16，未鑒定到微生物來源的蛋白，其中，α-淀粉酶抑制劑0.19為瓶裝紹興黃酒的主要成分。瓶裝紹興黃酒中的蛋白經(NH4)2SO4鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換柱純化α-淀粉酶抑制劑0.19，得到3個蛋白峰，其中1個穿透峰(峰1)，該峰所含蛋白的等電點≥8.0，2個洗脫峰(峰2、峰3)，等電點<8.0，目的蛋白α-淀粉酶抑制劑0.19主要存在于第3個蛋白峰中；第3個峰的蛋白經2次Sephacryl S-100葡聚糖凝膠層析純化后得到純的α-淀粉酶抑制劑0.19，經SDS-PAGE檢測，其分子質量為13.7 kDa。本試驗純化得到的α-淀粉酶抑制劑0.19屬于二聚體蛋白，在酒中可裂解為分子質量約為13.3 kDa的單體。