羅琴琪 李瀟

[摘要]目的：通過(guò)陽(yáng)極氧化二氧化鈦納米管負(fù)載不同濃度的蒲公英多糖，研究該復(fù)合涂層對(duì)牙齦卟啉單胞菌活性的影響，評(píng)價(jià)其抗菌性能。方法：設(shè)置陽(yáng)極二氧化鈦片為對(duì)照組（A組），陽(yáng)極二氧化鈦片負(fù)載不同濃度的蒲公英多糖為實(shí)驗(yàn)組：多糖濃度50mg/ml（B組），100mg/ml（C組），200mg/ml（D組）。場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（FESEM）觀察鈦片表面形貌結(jié)構(gòu)，X射線光電子能譜儀（XPS）檢測(cè)鈦片表面元素組成，臺(tái)盼藍(lán)染色熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)活菌/死菌比例數(shù)。結(jié)果：FESEM下觀察到各組鈦片表面管徑均一的納米管陣列，管徑80～100nm，實(shí)驗(yàn)組納米管表面可見(jiàn)白色粟粒狀顆粒沉積，D組>C組>B組;XPS顯示C含量顯著增加，特征性C峰值增高，D組>C組>B組;臺(tái)盼藍(lán)染色鏡下觀察牙齦卟啉單胞菌活菌呈現(xiàn)透明，死菌被染成藍(lán)色，單視野下死菌數(shù)量D組>C組>B組>A組，細(xì)菌活性（活菌/死菌×100%）D組

[關(guān)鍵詞]二氧化鈦納米管;蒲公英多糖;牙齦卟啉單胞菌;抗菌效應(yīng)

[中圖分類(lèi)號(hào)]R781.4+2? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2019）08-0109-03

牙科種植修復(fù)已經(jīng)成為牙列缺損或牙列缺失的一種常規(guī)治療手段，純鈦及其合金作為種植體材料具有良好的生物相容性。隨著口腔種植研究的不斷發(fā)展，簡(jiǎn)化治療流程，縮短治療時(shí)間，提高種植手術(shù)的遠(yuǎn)期成功率是目前最為關(guān)注的問(wèn)題。其根本解決辦法是對(duì)種植體表面進(jìn)行生化改性，以期加快形成種植體骨結(jié)合，早期功能負(fù)載，有效降低術(shù)后種植體周?chē)椎陌l(fā)生率。

隨著現(xiàn)代納米技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建微納米仿生表面形貌已逐步應(yīng)用到鈦種植體表面的處理。陽(yáng)極氧化技術(shù)（anodizing technology）是一種比較成熟的金屬表面改性方法，能在金屬表面形成納米級(jí)管狀結(jié)構(gòu)的氧化涂層。采用陽(yáng)極氧化法制備的二氧化鈦納米管陣列比表面積大、吸附能力強(qiáng)、生物相容性好，具有一定的抑菌性能，可作為載體進(jìn)行藥物傳送和加載生物活性因子[1-3]。蒲公英多糖（dandelion polysaccharide）是蒲公英植物的提取物之一，也是蒲公英的主要活性成分之一，蒲公英多糖具有抗菌、抗氧化、抗突變、抗疲勞、增強(qiáng)免疫、調(diào)節(jié)激素等多種藥理作用[4]，尤以抗菌效應(yīng)最為突出。孫繼梅等[5]采用微量肉湯稀釋法對(duì)臨床常見(jiàn)的203株分離菌進(jìn)行體外最小抑菌濃度測(cè)定，結(jié)果提示蒲公英對(duì)臨床常見(jiàn)的革蘭氏陽(yáng)性、陰性球菌均有較好抑菌活性。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）是牙周組織感染中最重要的致病菌，目前公認(rèn)菌斑聚集是導(dǎo)致種植體周?chē)椎氖紕?dòng)因子，尤以牙齦卟啉單胞菌多見(jiàn)。潘在興等[6]通過(guò)對(duì)種植體植入患者的齦溝菌斑標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，研究發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌可能是影響種植體周?chē)侵亟?，?dǎo)致邊緣骨吸收的原因之一。

本研究擬采用陽(yáng)極氧化技術(shù)制備二氧化鈦納米管，通過(guò)簡(jiǎn)單的物理吸附法負(fù)載不同濃度的蒲公英多糖，體外與牙齦卟啉單胞菌共培養(yǎng)，探索該復(fù)合涂層的抗菌性能，以期為鈦種植體表面生化改性提供一定的依據(jù)。

1? ?材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備：純鈦片（99.99%，陜西寶雞鵬潤(rùn)新金屬材料有限公司）、蒲公英多糖（95%，陜西慈緣生物技術(shù)有限公司）、牙齦卟啉單胞菌（廣東省微生物研究所）、臺(tái)盼藍(lán)（北京雷根生物技術(shù)有限公司）、BHI血瓊脂平板（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）、直流恒壓電源（DPM8600，杭州鈞策器械股份有限公司）、厭氧工作站（上海萬(wàn)銳實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）、場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（Merlin，德國(guó)）、X射線光電子能譜儀（THERMO FISHER SCIENTIFIC，美國(guó)）、倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，日本）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 二氧化鈦納米管的制備：商業(yè)圓形純鈦片（10mm×

10mm×1mm）依次經(jīng)800#、1000#、1200#鷹派砂紙打磨，丙酮、乙醇、去離子水超聲清洗，每次15min，空氣中干燥備用。在玻璃燒杯中配制300ml電解液（乙二醇97vol%、氟化銨0.5wt%、水3vol%）。連接直流恒壓電源，將鈦片置于陽(yáng)極，鉑片置于陰極，設(shè)置氧化電壓20V，氧化時(shí)間2h。氧化完成后鈦片置于450℃高溫馬弗爐中燒結(jié)3h，乙醇、去離子水超聲清洗，每次5min，鈦片清洗完成后置于烘烤箱中干燥備用。

1.2.2 蒲公英多糖的負(fù)載與實(shí)驗(yàn)分組：稱取一定量的蒲公英多糖粉末溶于無(wú)水乙醇/DMSO （DMSO<1vol%），分別配制濃度為50mg/ml、100mg/ml、200mg/ml的蒲公英多糖溶液。將陽(yáng)極氧化處理的鈦片分別置于三種不同濃度的多糖溶液，超聲振蕩處理30min。去離子水漂洗鈦片，去除表面未負(fù)載的多糖，空氣中干燥備用。設(shè)置陽(yáng)極氧化鈦片為對(duì)照組（A組），陽(yáng)極氧化鈦片負(fù)載不同濃度的蒲公英多糖為實(shí)驗(yàn)組：多糖濃度50mg/ml（B組），100mg/ml（C組），200mg/ml（D組）。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)鈦片表征測(cè)試：場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察試件表面形貌;X射線光電子能譜分析檢測(cè)試件表面元素組成。

1.2.4 牙齦卟啉單胞菌（Pg）的厭氧培養(yǎng)：自液氮罐內(nèi)取出凍存的牙齦卟啉單胞菌，復(fù)蘇于BHI血瓊脂平板（30%牛腦心浸出液、10%瓊脂、10%氯化血紅素+維生素K1溶液、10%脫纖維羊血），置于37℃厭氧工作站（80% N2、10% CO2、10% H2）培養(yǎng)4～5d。將BHI血瓊脂平板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)菌（表面光滑的黑色球形菌落）接種于BHI液體培養(yǎng)基，厭氧工作站中培養(yǎng)2d擴(kuò)增菌種。用細(xì)菌濁度儀配制密度1×106CFU/ml的菌懸液，分別吸取500?l菌懸液接種于孔板內(nèi)鈦片上，“+”字搖勻后放入工作站中厭氧培養(yǎng)48h。

1.2.5 牙齦卟啉單胞菌（Pg）活性檢測(cè)：取出孔板，棄上清液，PBS漂洗兩遍，用細(xì)胞刮分別從鈦片上刮取細(xì)菌至EP管，加入新鮮PBS重懸細(xì)菌。分別吸取180?l菌懸液至12孔板，加入0.4%的臺(tái)盼藍(lán)染液20?l，“+”字搖勻。熒光顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況，計(jì)算活/死菌比例。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）的形式呈現(xiàn)，采用單因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）和SNK-q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以百分率（%）的形式呈現(xiàn)，采用多個(gè)樣本率比較的卡方檢驗(yàn)（χ2）。假設(shè)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)ɑ=0.05，P<0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 試件表面形貌：FESEM結(jié)果：對(duì)照A組鈦片表面可見(jiàn)管徑均勻的納米管陣列，納米管管壁光滑，直徑約80～100nm（圖1a）。實(shí)驗(yàn)組（B、C、D組）鈦片表面可見(jiàn)納米管表面及管內(nèi)有白色粟粒狀顆粒物沉積（圖1b、圖1c、圖1d）。圖中可以看出顆粒物的量與負(fù)載蒲公英多糖的濃度呈正相關(guān)，D組>C組>B組。

2.2 試件表面元素分析：XPS檢測(cè)結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組（B、C、D組）和對(duì)照組（A組）鈦片表面均含有C、N、O元素，實(shí)驗(yàn)組特征性C元素峰值顯著增高，且與負(fù)載蒲公英多糖的濃度呈正相關(guān)，D組>C組>B組。

2.3 牙齦卟啉單胞菌（Pg）臺(tái)盼藍(lán)染色：臺(tái)盼藍(lán)染色結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察活菌呈現(xiàn)透明，死菌被染成藍(lán)色。實(shí)驗(yàn)組（B、C、D組）鈦片表面死菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組（A組），各實(shí)驗(yàn)組間鈦片表面死菌數(shù)量與負(fù)載蒲公英多糖的濃度呈正相關(guān)，D組>C組>B組。

2.4 牙齦卟啉單胞菌（Pg）活性：根據(jù)公式：細(xì)菌活性（活細(xì)菌率%）=活細(xì)菌總數(shù)/（活細(xì)菌總數(shù)+死細(xì)菌總數(shù)）×100%，計(jì)算四組鈦片表面細(xì)菌活性，得出細(xì)菌活性D組

3? 討論

3.1 二氧化鈦納米管負(fù)載蒲公英多糖復(fù)合涂層的制備：隨著現(xiàn)代納米技術(shù)的發(fā)展，材料表面納米化改性已成為增加鈦種植體表面粗糙度的一種優(yōu)良方法。有學(xué)陣列者研究表明，采用乙二醇-氟化銨水溶液為電解液，陽(yáng)極氧化電壓為20V，氧化時(shí)間為2h的條件下，可制備出高度有序的TNTs[7-8]。本實(shí)驗(yàn)采用相同的氧化參數(shù)成功在鈦片表面制備出二氧化鈦納米管，場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡下觀察納米管結(jié)構(gòu)規(guī)整，直徑約80～100nm，管壁光滑，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與以往研究相一致。

本研究采用簡(jiǎn)單的物理吸附法加載蒲公英多糖在鈦片表面納米管上，與其他生化改性方法相比，該負(fù)載方式保證了材料及活性分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物性能。對(duì)于多糖的微觀檢測(cè)，本研究在掃描電鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組鈦片納米管表面及內(nèi)部有粟粒狀顆粒物沉積，沉積量與多糖濃度成正相關(guān);XPS檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組鈦片表面特征性C元素峰值顯著增高，且峰值與多糖濃度成正相關(guān)。兩種檢測(cè)方法直接定性證實(shí)蒲公英多糖的成功負(fù)載，為該實(shí)驗(yàn)方案的后續(xù)實(shí)施奠定了基礎(chǔ)。本研究未對(duì)多糖負(fù)載作定量測(cè)定，故未能得到負(fù)載量與多糖濃度關(guān)系的精確數(shù)據(jù)支持，這也是本研究有待進(jìn)一步完善的地方。

3.2 二氧化鈦納米管負(fù)載蒲公英多糖復(fù)合涂層的抗菌性：目前公認(rèn)菌斑聚集是導(dǎo)致種植體周?chē)椎氖紕?dòng)因子，聚集在種植體周?chē)木咧饕獮楦锾m氏陰性厭氧菌，尤其是牙齦卟啉單胞菌[9-10]。為了研究蒲公英多糖改性的納米管的抗菌性，本研究選定了牙齦卟啉單胞菌為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)采用臺(tái)盼藍(lán)染色法檢測(cè)牙齦卟啉單胞菌活性，正?；罹そY(jié)構(gòu)完整，排斥臺(tái)盼藍(lán)染液進(jìn)入菌體，當(dāng)細(xì)菌活性喪失，胞膜通透性增加，因而被染成藍(lán)色。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，染色后顯微鏡下觀察到實(shí)驗(yàn)組鈦片表面死菌數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組中負(fù)載高濃度多糖的納米管表面死菌數(shù)量高于負(fù)載中濃度多糖的納米管（P>0.05）和負(fù)載低濃度多糖的納米管（P<0.05），可以得出二氧化鈦納米管負(fù)載蒲公英多糖復(fù)合涂層對(duì)牙齦卟啉單胞菌具有較強(qiáng)的抗菌性，在一定范圍內(nèi)，抗菌活性與蒲公英多糖濃度成正相關(guān)關(guān)系。關(guān)于蒲公英多糖的抗菌機(jī)制，有研究表明，蒲公英多糖可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成，促使細(xì)胞壁破裂，還能抑制DNA和蛋白質(zhì)的合成[11-12]。有關(guān)蒲公英多糖抑制牙齦卟啉單胞菌活性的具體作用機(jī)制尚不清楚，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2019-02-12

本文引用格式：羅琴琪，李瀟.二氧化鈦納米管負(fù)載蒲公英多糖對(duì)牙齦卟啉單胞菌活性的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2019，28（8）：109-112.