曲梅 黃瑛 張新 呂冰 賈蕾 田祎 王全意

傷寒、副傷寒是由傷寒和副傷寒(甲、乙、丙血清型)沙門(mén)菌引起，經(jīng)糞口途徑傳播，常引起急性腸道傳染病的暴發(fā)，屬于乙類(lèi)傳染病，一直是北京市重點(diǎn)監(jiān)控的傳染病之一。隨著衛(wèi)生環(huán)境的改善及綜合防治措施的落實(shí)，北京市傷寒、副傷寒的發(fā)病得到有效控制，維持在較低水平，但仍有散發(fā)病例持續(xù)存在[1,2]。近年來(lái)，在抗生素的選擇壓力下，沙門(mén)菌耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重[3]。為更好地開(kāi)展監(jiān)測(cè)和防控工作，了解傷寒、副傷寒菌型變遷和流行特征，現(xiàn)將北京市2008-2018年傷寒、副傷寒沙門(mén)菌臨床分離株進(jìn)行血清型、耐藥性和分子分型分析。

1 材料與方法

1.1菌株來(lái)源 2008-2018年，北京市腸道門(mén)診監(jiān)測(cè)系統(tǒng)采集的腹瀉患者標(biāo)本，經(jīng)各區(qū)疾控中心進(jìn)行分離培養(yǎng)，初步鑒定為傷寒、副傷寒沙門(mén)菌的散發(fā)臨床分離株56株，及一起輸入性傷寒暴發(fā)疫情的9株菌，共計(jì)65株。

1.2方法

1.2.1菌株鑒定： 傷寒、副傷寒沙門(mén)菌的分離培養(yǎng)參照衛(wèi)生部行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS280-2008附錄A進(jìn)行。將各區(qū)上送的可疑傷寒、副傷寒沙門(mén)菌轉(zhuǎn)種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上過(guò)夜培養(yǎng)，采用法國(guó)梅里埃公司VITEK2-Compact全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定。

1.2.2血清分型試驗(yàn)： 針對(duì)沙門(mén)菌群(A～F)多價(jià)血清、菌體(O)抗原、鞭毛(H)抗原和Vi抗原進(jìn)行血清凝集試驗(yàn)。方法為挑取三糖斜面上少量菌苔與A～F多價(jià)抗血清在室溫下進(jìn)行玻片凝集，1 min 內(nèi)出現(xiàn)凝集顆粒為陽(yáng)性；按同樣方法與O單價(jià)抗血清進(jìn)行逐一凝集來(lái)確定O抗原，根據(jù)確定的O抗原進(jìn)行相應(yīng)的H多價(jià)和單價(jià)血清凝集以確定最終血清型。玻片凝集時(shí)需設(shè)生理鹽水對(duì)照。沙門(mén)菌診斷血清為丹麥SSI血清研究所產(chǎn)品，均在有效期內(nèi)使用。

1.2.3藥敏試驗(yàn)： 采用最小抑菌濃度(minimal inhibition concentration，MIC)法，使用上海星佰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的革蘭陰性需氧菌藥敏檢測(cè)板，藥物應(yīng)用環(huán)丙沙星(CIP)、鏈霉素(STR)、氨芐西林(AMP)、氯霉素(CHL)、磺胺異噁唑(SUL)、復(fù)方新諾明(SXT)、萘啶酸(NAL)、阿莫西林-克拉維酸(AUG)、頭孢曲松(CRO)、強(qiáng)力霉素(DOX)、慶大霉素(GEN)、阿奇霉素(AZM)、四環(huán)素(TET)、頭孢西丁(FOX)、頭孢吡肟(FEP)以及亞胺培南(IMP)16種藥物進(jìn)行沙門(mén)菌耐藥性檢測(cè)，其結(jié)果與美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)2016年標(biāo)準(zhǔn)比較，以大腸埃希菌(ATCC25922)做為質(zhì)控菌株。對(duì)三種及以上抗生素耐藥，既為多重耐藥(multidrug resistance, MDR)。

1.2.4脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)： 參照PulseNet制定的沙門(mén)菌脈沖場(chǎng)電泳標(biāo)準(zhǔn)分型方法。沙門(mén)菌標(biāo)準(zhǔn)株H9812做為分子量標(biāo)記。內(nèi)切酶 XbaI(40 U)，37 ℃酶切3 h。電泳條件：電壓6 v/cm，脈沖時(shí)間從2.2～63.8 s，線性轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換角度120°，電泳時(shí)間19 h，電泳溫度14 ℃。脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀為Bio-Rad，CHEF III；凝膠成像系統(tǒng)為Bio-Rad Gel-DOCXR。內(nèi)切酶購(gòu)自New England公司。采用國(guó)家致病菌識(shí)別網(wǎng)信息化平臺(tái)系統(tǒng)對(duì)電泳圖像進(jìn)行處理、網(wǎng)絡(luò)化數(shù)據(jù)傳輸和比對(duì)分析。聚類(lèi)樹(shù)狀圖根據(jù)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法(unweighted pair-group method using arithmetic averages，UPGMA) 構(gòu)建。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件和WPS 2016專(zhuān)用版對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行頻數(shù)和百分構(gòu)成分析。

2 結(jié)果

2.1血清分型及年齡組情況 2008-2018年，傷寒、副傷寒沙門(mén)菌株共65株，分布于北京市16個(gè)區(qū)。男女比例1.2∶1(35/30)，以男性居多。其中，傷寒沙門(mén)菌24株，占36.9%，主要分布于2008、2010、2013和2015-2017年，平均每年2～5株，2018年，有一起輸入性傷寒暴發(fā)分離到9株菌。甲型副傷寒沙門(mén)菌7株，占10.8%，主要分布在2013-2015和2017年；乙型副傷寒沙門(mén)菌20株，占30.8%，主要分布在2009-2011和2013-2016和2018年；丙型副傷寒沙門(mén)菌14株，占21.5%，主要集中在2009-2012年。年齡分布0～10歲組和31～40歲組最多，均占24.6%，其次是41～50歲組和21～30歲組，分別占18.5%和13.8%，11～20歲組最少占4.6%(表1)。

2.2藥敏試驗(yàn)結(jié)果 65株傷寒、副傷寒沙門(mén)菌對(duì)16種抗生素的敏感和耐藥程度不同(表2)。傷寒沙門(mén)菌對(duì)萘啶酸的耐藥率最高為20.8%，其次為鏈霉素和磺胺異噁唑，而對(duì)頭孢類(lèi)抗生素、阿莫西林-克拉維酸、強(qiáng)力霉素，阿奇霉素和亞胺培南等均100%敏感。甲型副傷寒沙門(mén)菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)抗生素萘啶酸和環(huán)丙沙星的耐藥率分別為100.0%和57.1%，對(duì)氯霉素和磺胺異噁唑的耐藥率均為14.3%，對(duì)其他抗生素均敏感。乙型和丙型副傷寒沙門(mén)菌對(duì)磺胺異噁唑的耐藥率分別為20.0%和35.7%，對(duì)其它抗生素的耐藥率均低于10%。臨床上治療腹瀉常用的頭孢菌素、環(huán)丙沙星(除甲型副傷寒外)，以及氨基糖甙類(lèi)慶大霉素對(duì)4種血清型沙門(mén)菌普遍較敏感，敏感率均>75%。多重耐藥分析顯示，甲型副傷寒的多重耐藥最明顯，耐藥率達(dá)到28.6%，存在對(duì)8種抗生素的聯(lián)合耐藥。傷寒沙門(mén)菌多重耐藥率最低，為4.2%。

表1 傷寒、副傷寒沙門(mén)菌株不同年齡組、性別及血清型分布

表2 2008-2018年傷寒、副傷寒沙門(mén)菌耐藥情況

2.3PFGE分子分型 用限制性?xún)?nèi)切酶XbaI 將傷寒、乙型副傷寒和丙型副傷寒沙門(mén)菌共58株菌，全基因組酶切后，每株菌產(chǎn)生12～20條電泳條帶，各片段分子量為20～700 kb。各菌株圖譜間DNA條帶數(shù)量和位置完全相同為同一型別，若有1條或1條以上的條帶差別，即判為不同的型別。58株菌分為34種帶型(Sal.BJ001～Sal.BJ034)，經(jīng)聚類(lèi)分析，總體相似系數(shù)在32.2%～100%，帶型分散，無(wú)明顯優(yōu)勢(shì)型別(圖1)。其中2018年的9株傷寒沙門(mén)菌帶型一樣Sal.BJ0032，為一起輸入性暴發(fā)，占15.6%，但與其它型別存在明顯差異,有5種型別分別包含3株菌，各占5.2%,6種型別分別包含2株菌，各占3.4%。雖然這些菌株克隆來(lái)源一樣，但病例均來(lái)自不同的區(qū)，不同的年份，沒(méi)有流行病學(xué)上的關(guān)聯(lián)。其余22種帶型都只有1株菌。

3 討論

3.1全球范圍傷寒或副傷寒流行與菌株的優(yōu)勢(shì)血清型有關(guān)，存在變遷替換現(xiàn)象[4]。此次分析發(fā)現(xiàn),2008-2018年，北京市腸道門(mén)診監(jiān)測(cè)系統(tǒng)腹瀉患者糞便標(biāo)本中傷寒、副傷寒沙門(mén)菌維持在較低水平。2008-2012年，傷寒沙門(mén)菌和乙型、丙型副傷寒沙門(mén)菌均有流行或交替出現(xiàn)，但2013年以后，則主要以傷寒沙門(mén)菌和乙型副傷寒為主，偶有甲型副傷寒的散在菌株。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，甲型副傷寒多是在沿海地區(qū)、西南部省份和東部省份高發(fā)，江西、浙江、廣西、云南等地多次出現(xiàn)暴發(fā)疫情，并在長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)擴(kuò)散[5]。此次研究結(jié)果顯示，65株傷寒副傷寒沙門(mén)菌以0～10歲組和31～40歲年齡組居多，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[1,3]。世界衛(wèi)生組織一直認(rèn)為5～15歲組是傷寒、副傷寒的高發(fā)年齡組[4]，這與低齡段兒童，免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，自身抵抗力較弱，容易受細(xì)菌和病毒的侵犯有關(guān)[6,7]。傷寒、副傷寒散發(fā)病例的主要傳播途徑為污染的食物(特別是海產(chǎn)品)。青壯年作為社會(huì)的主要生產(chǎn)力，外出工作就餐的機(jī)會(huì)多，故接觸病原體的機(jī)會(huì)較多，易患病?？傊?，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)低齡兒童和重點(diǎn)人群的監(jiān)測(cè)和防控，加強(qiáng)食品安全和公共衛(wèi)生監(jiān)管、保護(hù)易感人群、防止病從口入。

圖1 58侏傷寒、副傷寒沙門(mén)菌PFGE聚類(lèi)分析圖

3.2PFGE是公認(rèn)的細(xì)菌分子流行病研究的“金標(biāo)準(zhǔn)”，其優(yōu)勢(shì)是直接針對(duì)整個(gè)細(xì)菌染色體DNA進(jìn)行分析，分辨能力強(qiáng)、實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定、重復(fù)性好[8]。北京市傷寒、副傷寒沙門(mén)菌的PFGE型別較多且分散，表明患者間菌株的遺傳親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，流行病學(xué)表現(xiàn)為高度散發(fā)，無(wú)聚集性。近10年來(lái)，北京市確實(shí)沒(méi)有傷寒或副傷寒的暴發(fā)疫情[1]。但在2018年夏天，通過(guò)北京市腸道門(mén)診病例監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)某區(qū)環(huán)建公司工人集體去外地勞務(wù)支援，時(shí)隔一個(gè)月后回京陸續(xù)發(fā)病，引起傷寒輸入性暴發(fā)，共分離到9株傷寒沙門(mén)菌，經(jīng)PFGE圖譜分析發(fā)現(xiàn)，該起暴發(fā)為同一克隆來(lái)源。隨即展開(kāi)流調(diào)和異地協(xié)查，由于是京外感染，空間的阻隔和時(shí)間的滯后，很遺憾最終沒(méi)能追溯到感染來(lái)源，但這提出了警示：目前傷寒、副傷寒病例癥狀越來(lái)越不典型，發(fā)病周期和潛伏期長(zhǎng)、易復(fù)發(fā)，且存在慢性帶菌。雖然流行方式多呈散發(fā)，但城市化和全球化對(duì)公共衛(wèi)生的影響越來(lái)越大，北京流動(dòng)人口數(shù)量巨大，人口流動(dòng)會(huì)帶來(lái)傳染源輸入風(fēng)險(xiǎn)，而且這種風(fēng)險(xiǎn)會(huì)持續(xù)存在，隨時(shí)都有暴發(fā)的可能，因而要引起廣泛關(guān)注。

3.3與既往本地區(qū)的研究數(shù)據(jù)相比[9]，傷寒、副傷寒沙門(mén)菌對(duì)磺胺異噁唑、萘啶酸、鏈霉素和氨芐西林等經(jīng)典抗生素耐藥率在增加。雖然不同血清型對(duì)各種抗生素的耐藥率有明顯差異，但總體上對(duì)阿莫西林克拉維酸、強(qiáng)力霉素、阿奇霉素和亞胺培南所有菌株均敏感。甲型副傷寒沙門(mén)菌的耐藥率高于傷寒沙門(mén)菌和其它兩型，這與浙江等地的研究結(jié)果一致[10]。值得關(guān)注的是，本研究顯示甲型副傷寒沙門(mén)菌對(duì)第1代喹諾酮類(lèi)藥物萘啶酸100%耐藥，而氟喹諾類(lèi)藥物環(huán)丙沙星的耐藥率已上升為57.1%，敏感率只有14.3%，且患者年齡<18歲禁用喹諾酮類(lèi)藥物，臨床用藥應(yīng)引起足夠重視。臨床上兒科常用藥大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)的阿奇霉素和第3、4代頭孢菌素對(duì)各種血清型敏感率都很高，應(yīng)該是治療傷寒、副傷寒沙門(mén)菌感染的首選藥。該地區(qū)傷寒、副傷寒菌株耐藥率的逐步增高和多重耐藥株的出現(xiàn)讓人憂慮。抗生素的濫用及不規(guī)范使用是導(dǎo)致細(xì)菌耐藥的一個(gè)重要因素，臨床上在治療時(shí)，必須了解目前流行的血清型和耐藥模式，有針對(duì)性的合理選用抗生素，以確保其安全性和療效。因此，要持續(xù)、系統(tǒng)地開(kāi)展傷寒、副傷寒病原學(xué)和耐藥監(jiān)測(cè)，以了解該地區(qū)沙門(mén)菌流行血清型及其相應(yīng)的耐藥性變化規(guī)律，為臨床治療提供數(shù)據(jù)支持。