王旭杰 蔡蓓珺

(上海市長(zhǎng)寧區(qū)婦幼保健院婦科，上海 200051)

宮頸癌為目前最常見的女性惡性腫瘤之一，DNA依賴性蛋白激酶(DNA-depended protein kinase，DNA-PK)作為DNA靶向性和調(diào)節(jié)性成分，在DNA修復(fù)中發(fā)揮重要的作用，高表達(dá)意味著修復(fù)能力的提高[1-3]。國(guó)外關(guān)于DNA-PK在放化療宮頸癌患者中的表達(dá)已有報(bào)道，但國(guó)內(nèi)這方面資料尚少，且關(guān)于DNA-PKcs表達(dá)與預(yù)后關(guān)系尚不清楚[4-5]。本研究觀察了DNA-PKcs蛋白在放化療宮頸癌患者中的表達(dá)，及其與生存相關(guān)，為提高宮頸癌放化療的敏感性提供新途徑。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月至2013年7月我科治療的Ⅱb～Ⅲb期宮頸癌患者109例，年齡23～75歲，平均(45.6±9.73)歲。入選標(biāo)準(zhǔn)：明確診斷為Ⅱb～Ⅲb期宮頸癌；均未經(jīng)過其他化療藥物治療；檢查肝腎功能、肺功能、心電圖均正常，無化療禁忌；能配合治療，無藥物過敏史者。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他組織器官腫瘤者；(2)不配合治療者，隨訪資料缺失者；(3)伴有嚴(yán)重的神經(jīng)和精神障礙的患者。患者腫瘤特征，如分期、腫瘤大小、病理組織學(xué)類型和分級(jí)與RT后腫瘤緩解程度見表1。本文經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或患者家屬均簽署了知情同意書。

表1 與腫瘤緩解相關(guān)的腫瘤特征

1.2 治療方法 體外照射野采用6-MVX線直線加速器，全骨盆外照射(EBRT)和低劑量率或高劑量率聯(lián)合使用。前后對(duì)穿照射，每周5次，每次1野，每野盆腔中平面劑量(DT)2Gy。當(dāng)達(dá)到DT30Gy時(shí)改為盆腔四野照射，于全盆照射中央擋鉛(4～5) cm×(10～11) cm，每次每野DT 2Gy，每周5次，總量DT 20Gy。大野10次后同時(shí)給予192銥腔內(nèi)后裝治療，每次A點(diǎn)6Gy，每周1～2次，共7次，A點(diǎn)總量42Gy。同步采用經(jīng)股動(dòng)脈穿刺雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈灌注化療，藥物選擇順鉑、環(huán)磷酰胺、阿霉素或5-Fu，二聯(lián)或三聯(lián)用藥。根據(jù)臨床療效及檢查結(jié)果選擇1～4個(gè)療程的動(dòng)脈灌注化療，療程間隔3周，每個(gè)療程結(jié)束后2周評(píng)估介入療效，符合下列情況且具備手術(shù)條件者行根治性手術(shù)：(1)宮頸基本光滑或?qū)m頸腫瘤縮小2/3，臨床分期出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)；(2)宮旁組織變松軟有彈性；(3)無嚴(yán)重的介入化療損傷。此時(shí)可行廣泛子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。放化療敏感性的評(píng)估由手術(shù)切除的標(biāo)本1周內(nèi)組織病理學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。免疫組化檢測(cè)DNA-PK蛋白表達(dá)及結(jié)果判斷：采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)標(biāo)本中的DNA-PK表達(dá)，標(biāo)本經(jīng)福爾馬林固定后液體石蠟包埋，制成4μm厚度連續(xù)切片。先行梯度酒精脫水，然后采用PBS緩沖液沖洗，加入生物學(xué)一抗過夜，山羊血清封閉后加人生物學(xué)二抗，DAB顯色。梯度酒精水化后采用蘇木精復(fù)染，再以中性樹膠封片。SP-9002免疫組化試劑盒與PBS緩沖液均購自廣州安必平醫(yī)藥科技公司，檢驗(yàn)醫(yī)師嚴(yán)格遵照說明書操作。DNA-PK以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性，同時(shí)隨機(jī)選取每張切片10個(gè)400倍視野，并綜合染色強(qiáng)度以及陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行判定[5]，染色強(qiáng)度評(píng)分：0分為不著色，1分為黃色，2分為棕黃色，3分為黃褐色。陽性細(xì)胞占比評(píng)分[6]：0分為陽性細(xì)胞占比<5%，1分為陽性細(xì)胞占比在5%～24%之間，2分為陽性細(xì)胞占比在25%～49%之間，3分為陽性細(xì)胞占比在50%～74%之間，4分為陽性細(xì)胞占比>75%。染色強(qiáng)度評(píng)分×陽性細(xì)胞占比評(píng)分即為綜合評(píng)分，其中0分記為陰性，1～12分記為陽性。隨訪：患者均自電話或門診隨訪，術(shù)后隨訪5年，失訪人群在生存分析前刪除。

2 結(jié) 果

2.1 兩組標(biāo)本中DNA-PK陽性率表達(dá) DNA-PK蛋白主要位于細(xì)胞核，在正常宮頸組織中表達(dá)呈陰性，宮頸癌周圍淋巴結(jié)組織中呈淡黃色或黃色陽性(++)表達(dá)，低分化腺癌組織、鱗狀細(xì)胞癌癌組織中呈棕褐色強(qiáng)陽性表達(dá)(+++)。見圖1。pCR組的DNA-PK陽性率(56/85，65.8%)低于non-pCR組(18/24，75.0%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.06，P=0.04)。見表1。

表2 pCR組及non-pCR組DNA-PK蛋白陽性表達(dá)率比較(n，%)

注：A DNA-PK在正常宮頸組織中不表達(dá)；B DNA-PK在宮頸癌周圍淋巴結(jié)中弱表達(dá)；C DNA-PK在低分化腺癌組織中高表達(dá)；D DNA-PK在鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)。

圖1 DNA-PK在宮頸癌及正常組織中的表達(dá)情況

2.2 DNA-PK的表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系 109例宮頸癌患者均自電話或門診隨訪，術(shù)后隨訪5年，隨訪截至日期為2018年8月3日，109例患者中，105例完成隨訪，2例DNA-PK蛋白表達(dá)陽性患者失訪，失訪率為1.8%(2/109)，失訪人群在生存分析前刪除。隨著DNA-PK表達(dá)水平增加，患者中位生存時(shí)間逐漸縮短，DNA-PK表達(dá)水平不同的三組患者1、3 和 5 年生存率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。采用 Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)103例宮頸癌患者的5年生存影響因素進(jìn)行分析， 結(jié)果顯示：DNA-PK 蛋白(+++)表達(dá)(P=0.002)、分化程度越低(P=0.036)、浸潤(rùn)深度越高(P=0.001)和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.002)是宮頸癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

表3 不同水平DNA-PK表達(dá)的宮頸癌患者中位生存時(shí)間和生存率

表4 影響宮頸癌患者5年生存結(jié)局的COX模型多因素分析

注：總χ2=47.20，ν=5，P<0.001。

3 討 論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，呈逐年上升趨勢(shì)。電離輻射可以損傷腫瘤細(xì)胞DNA，殺死細(xì)胞，而腫瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性取決于DNA雙鏈斷裂(DSBS)修復(fù)。非同源末端連接(NHEJ)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞DNA DSBS修復(fù)的主要途徑[7]。DNA-PK在NHEJ過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。DNA-PK由一個(gè)催化亞基DNA-PKcs(大小470 kD)和2個(gè)調(diào)節(jié)亞基Ku70、Ku80組成[8]。DNA-PKC為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇-3激酶相關(guān)激酶家族，包括其他涉及DNA修復(fù)信號(hào)的蛋白，如ATM和ATR[9]。ATM中的基因突變DNA PKC基因?qū)е旅庖呷毕?、癌癥易感性對(duì)電離輻射具有超敏反應(yīng)。目前，人腫瘤細(xì)胞系膠質(zhì)母細(xì)胞，肺癌細(xì)胞系細(xì)胞中DNA PKC含量與輻射敏感性的相關(guān)性已經(jīng)得到證實(shí)[10]。另外學(xué)者研究了I b～Ⅱa期子宮頸癌組織中DNA損傷反應(yīng)蛋白與腫瘤放療敏感性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中DNA-PKcs、Ku86、Ku70表達(dá)明顯高于相鄰的非瘤組織，而且三者密切相關(guān)；但結(jié)論是DNA-PK各亞基在瘤組織中的表達(dá)水平不能作為早期宮頸癌放射敏感性的預(yù)測(cè)指標(biāo)[11]。研究[12]發(fā)現(xiàn)，DNA-PKcs在肺癌、食管癌、大腸癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)，且可以降低腫瘤的放療敏感度。有研究用免疫組化法檢測(cè)DNA-PKcs蛋白在治療前I B～ⅡB期宮頸癌組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNA-PKcs在放療敏感組32例中僅有7例高表達(dá)，放療抗拒組31例中有30例高表達(dá)，DNA-PKcs高表達(dá)組總生存時(shí)間均數(shù)比低表達(dá)組短[13]。本研究結(jié)果顯示，病理緩解宮頸癌中的DNA-PK陽性率低于病理無緩解宮頸癌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示DNA-PKcs的低表達(dá)是宮頸癌對(duì)放化療敏感的一項(xiàng)參考指標(biāo)。因?yàn)榉派渚€是通過損傷細(xì)胞DNA導(dǎo)致細(xì)胞壞死凋亡而殺死腫瘤細(xì)胞，而抗腫瘤藥物是在腫瘤細(xì)胞增值周期中破壞或抑制DNA的合成而殺滅腫瘤細(xì)胞。如果腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)基因過度表達(dá)，腫瘤細(xì)胞可能快速修復(fù)，從而對(duì)放療和化療產(chǎn)生耐受，使治療難以奏效。因此，在治療之前，檢測(cè)患者宮頸癌組織中DNA-PKcs的表達(dá)水平，可以較好地預(yù)測(cè)宮頸癌的放化療敏感性，對(duì)臨床治療方案的選擇有著重要的指導(dǎo)意義。DNA-PK與宮頸癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)有關(guān)，可作為宮頸癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)因子。DNA-PK蛋白(+++)表達(dá)死亡風(fēng)險(xiǎn)更大，5年生存率及中位生存時(shí)間更低。因此推測(cè)，DNA-PK蛋白的高表達(dá)可能反映了宮頸癌患者的不良預(yù)后結(jié)局。采用 Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)103例宮頸癌患者的5年生存影響因素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：DNA-PK 蛋白(+++)表達(dá)(P=0.002)、分化程度越低(P=0.036)、浸潤(rùn)深度越高(P=0.001)和有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(P=0.002)是宮頸癌患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。這些均提示宮頸癌組織中的DNA-PK表達(dá)與宮頸癌預(yù)后有關(guān)，可能成為檢測(cè)宮頸癌患者病情以及評(píng)估宮頸癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。

總之，DNA-PK在宮頸癌組織中高表達(dá)可能與放化療抵抗、預(yù)后有關(guān)，但其機(jī)制尚需要更進(jìn)一步的探討，阻斷DNA-PK信號(hào)傳導(dǎo)通路有可能成為增加放化療敏感性的方法。