李莉 吳永潔 王元素

摘要：采用簡單重復序列（SSR）分子標記技術，對19份分別來源于同一花序的貴州野生白三葉樣品進行遺傳多樣性及親緣關系研究。結果表明，利用20對引物共擴增出207個條帶，其中178個條帶具有多態(tài)性。20對引物多態(tài)性位點的比例為76.92%～92.31%，平均多態(tài)性為85.99%。20對引物對19份白三葉材料SSR的PCR擴增條帶的多態(tài)信息含量為 0.380 6～0.499 7，平均為0.463 2。在相似系數為0.60時，把19份白三葉材料劃分為3大類。第1類是W18，最早被分開獨立成一類，從SSR標記來看，W18與其余材料的親緣關系較遠。第2類包括W2和W13，表明這2個居群間親緣關系較近，遺傳差異不大。第3類為剩下的16個品種，居群間的遺傳關系較復雜。

關鍵詞：貴州;野生白三葉;同一花序;遺傳多樣性;SSR

中圖分類號： S541+.903.2 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0049-05

植物在進化過程中，形成了適應外界環(huán)境變化的功能性狀[1]，但研究表明，植物遺傳背景是植物功能性狀變異的主要來源之一，甚至大于環(huán)境因素的影響[2]。張莉等研究也提出研究植物性狀對環(huán)境變化的響應，必須明確遺傳背景與環(huán)境對植物性狀的相對影響，以排除遺傳背景的作用[3]。

在植物不同花或花序之間存在不同程度的繁殖資源分配和競爭問題，即植株不同部位的花甚至是同一個花序內不同部位花的地位是不平等的，存在明顯的位置效應[4]，導致同株植物甚至同一花序不同位置的小花、果實和種子的數量、大小、形態(tài)及繁殖效率可能存在差異[5]。張鶴山等研究表明，不同取樣地紅三葉的單株花序數和單個花序小花數的變異是體現多樣性的重要指標[6]。劉左軍等統(tǒng)計不同部位頭狀花序的生物量投入，并分析了存在于總狀花序內資源分配上的結構效應及其對不同生境條件的反應[4]。

白三葉是多年生優(yōu)質豆科牧草，為異花授粉植物，廣泛分布于世界各地，在畜牧業(yè)發(fā)展中起重要作用。吳永潔等采用溫室大棚培養(yǎng)，用來源于同一花序的白三葉作為試驗材料，研究貴州野生白三葉的形態(tài)多樣性，以排除環(huán)境因素對試驗的影響，在同一花序水平上研究形態(tài)多樣性，可以減少基因漂移和花粉污染等因素的影響，為進一步研究其遺傳水平上的多樣性提供基礎數據[7]。目前簡單重復序列（SSR）已被廣泛應用于各種研究，如遺傳多樣性分析[8]、種質分子身份證的構建[9]、遺傳連鎖圖繪制及QTL定位[10]、目標性狀基因定位和分子標記輔助育種[11]等。本研究以貴州省境內19份野生白三葉種質為研究對象，比較同一花序水平上的遺傳多樣性，可為下一步選育優(yōu)質高效白三葉新品種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2013年5—8月在貴州省范圍內收集野生白三葉種子，共收集19份種質，具體收集地點見表1。

1.1.2 溫室栽培 于2014年9月20日在貴州省牧草種子檢測中心溫室大棚內播種。參照吳永潔等的方法[7]，從19份材料中各選取1個果實飽滿的花序，將來自同一花序的種子播入有32個小格的育苗盤中，每小格播2粒種子，3個月成苗期后，在形態(tài)多樣性研究的基礎上，選擇形態(tài)上有代表性的幼苗進行SSR標記試驗。

1.1.3 試驗試劑 DNA提取試劑盒（購自大連寶生物公司）;26對SSR引物（由大連寶生物公司合成）。

1.2 白三葉總DNA提取

取野生白三葉新生葉片，提取總DNA。用0.75%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。

1.3 SSR-PCR擴增體系與程序

參考牟彤等的白三葉SSR分析體系[12-13]，通過單因素梯度組合試驗，得到優(yōu)化后最優(yōu)的白三葉20 μL反應體系：模板20 ng，10×PCR Bufer 2 μL，Mg2+（25 mmol/L）2.4 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/μL） 0.1 μL，上、下游引物均為0.6 μL（0.1 mmol/μL），用滅菌水補足20 μL，覆蓋礦物油。

1.4 引物篩選

參照Zietkiewicz等的研究[14-15]，挑選出多樣性較高的26對SSR引物，并將其交由大連寶生物公司合成。從供試材料中選出質量較高且形態(tài)性狀差異較大的W11及W12材料對26對引物進行剔選，最終選出20對多態(tài)性好、穩(wěn)定性高、條帶清晰的引物對全部材料進行PCR擴增，引物序列見表2。

1.5 數據處理

對凝膠電泳后獲得清晰穩(wěn)定的DNA擴增條帶進行統(tǒng)計，在相同遷移位置上的譜帶，有帶的賦值為“1”，無帶的賦值為“0”，建立遺傳相似矩陣。通過該矩陣，統(tǒng)計SSR-PCR擴增產物總條帶數和具有多態(tài)性的條帶數，用Excel計算多態(tài)性位點百分率PPB（PPB=NPB/TNB×100%，其中TNB指 SSR-PCR 擴增的總條帶數，NPB指具有多態(tài)性的條帶數[16]）、標記指數MI（MI=NPB×PIC）[17]、引物多態(tài)性信息含量PIC[PIC=2fi（1-fi），其中fi表示有帶的所占的頻率]。用NTSYS-PC 2.02軟件計算Dice遺傳距離GD[GD=1-2Nij/（Ni+Nj），其中Ni指材料i中出現的擴增片段數，Nj指材料j中出現的擴增片段數，Nij指材料i和j共有的擴增片段數]，用以估計各白三葉種質間的遺傳多樣性[16，18]。根據非加權組平均法（UPGMA）法進行遺傳相似性聚類分析[19]。

2 結果與分析

2.1 貴州野生白三葉同一花序DNA純度檢測

采用0.75%瓊脂糖凝膠電泳對提取的19份野生白三葉DNA進行檢測，結果見圖1（圖中1～19對應19份材料），可見DNA的完整性較好，純度較高。