黃紅連

(深圳市南山區(qū)西麗人民醫(yī)院，廣東 深圳 518055)

眾所周知，乙型肝炎病毒所引發(fā)的肝炎是全世界范圍內(nèi)所重點關(guān)注的問題之一，且有相關(guān)研究報道顯示，截止2008年，全球慢性乙型肝炎病毒感染患者約有4億人，其中約有25%的患者會進展成為肝硬化或肝細胞癌[1]。迄今為止，臨床上主要采用核苷酸類似物以及干擾素等藥物進行抗乙型肝炎病毒治療[2，3]。且近年來恩替卡韋以及阿德福韋酯等新型藥物開始被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，具有抗乙型肝炎病毒效果更明顯，耐藥率更低的優(yōu)勢。然而，上述藥物無法清除肝細胞核中的共價閉合環(huán)狀DNA，因此無法徹底治愈乙型肝炎病毒感染[4]。由此，對乙型肝炎病毒感染的發(fā)病機制進行深入的研究，從而尋找治療乙型肝炎病毒感染的新手段是臨床肝病專家們關(guān)注的重點。其中，NK細胞屬于天然免疫系統(tǒng)中重要細胞之一，主要是通過分泌細胞因子以及特異性殺傷病毒感染的細胞，從而起到抗病毒作用[5]。鑒于此，本文通過研究乙型肝炎病毒對NK細胞免疫活性的影響作用，旨在為臨床乙型肝炎病毒感染的治療提供指導(dǎo)作用，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1．1 研究材料 HepG2．2．15細胞來自荷蘭鹿特丹伊拉斯慕斯醫(yī)學(xué)院胃腸病肝病部實驗室；流式細胞儀FACS CantoⅡ以及細胞分選儀FACS-Aria均購自美國BD公司；IFNγ特異性酶聯(lián)免疫吸附法定量試劑盒購自美國eBioscience公司；NK細胞分離試劑盒購自德國Miltenyi公司；過濾儀Centricon Plus-70購自美國Millipore公司。

1．2 研究方法 ⑴乙型肝炎病毒獲?。翰捎?0%胎牛血清以及1%請鏈霉素的培養(yǎng)液對HepG2．2．15細胞進行培養(yǎng)。采集對數(shù)生長期的細胞上清液，采用過濾器進行分離純化乙型肝炎病毒，并通過PCR技術(shù)定量測定病毒量。⑵外周血pDC與NK細胞的提?。菏紫韧ㄟ^淋巴細胞分離液密度梯度離心法對研究對象的外周血單個核細胞（PBMC）進行提取，同時以藻紅蛋白抗血液樹突狀細胞抗原4單克隆抗體對PBMC進行標記，洗滌后進行抗PE磁株標記。隨后采用磁株陽性分選法對PBMC中的抗血液樹突狀細胞抗原4陽性細胞進行分離，以FACS-Aria分選儀獲取高純度的抗血液樹突狀細胞抗原4陽性細胞，即純度＞99%的外周血pDC。NK細胞分離時機和通過陰性選擇的方式提取外周血NK細胞，并采用流式雙染色法測定NK細胞純度。⑶NK細胞分泌的IFNγ量測量：對健康對照組的外周血NK細胞進行單獨培養(yǎng)，同時加入10ng/ml的白細胞介素12（IL-12）以及IL-18進行刺激。將外周血來源的NK細胞和來自同一研究對象的外周血pDC按照5：1的比例共同放置于96孔板中，以含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。時候分別加入4×106/ml的乙型肝炎病毒、10μg/ml的CpG寡脫氧核酸以及皰疹病毒進行刺激。分別采用酶聯(lián)免疫吸附法定量試劑盒與Model 680微板讀數(shù)儀，測量450nm處的吸光度，計算IFNγ的含量。⑷NK細胞內(nèi)IFNγ的測量：采用細胞內(nèi)細胞因子染色法進行測定，即在培養(yǎng)結(jié)束后對細胞進行洗滌，標記細胞表面抗體，經(jīng)由2%的中性加權(quán)固定20min后標記細胞內(nèi)的抗體，再次對細胞進行洗滌后采用流式細胞儀進行檢測。⑸NK細胞殺傷毒性檢測：將NK細胞與熒光標記的K562細胞共同溫育4h，待細胞洗滌后，加入7-氨基放線菌素D進行流式細胞檢測，并根據(jù)7-氨基放線菌素D以及細胞熒光雙養(yǎng)性進行K562細胞死亡情況的評估。

1．3 觀察指標 分析乙型肝炎病毒對NK細胞分泌IFNγ的影響、乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ的影響、乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞殺傷靶細胞K562的影響。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 20．0軟件進行檢測分析，采用“χ2”檢驗、t檢驗，用“[n(%)]”表示計數(shù)資料，用“（x±s）”表示計量資料均數(shù)標準差。P值＜0．05為兩組數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 乙型肝炎病毒對NK細胞分泌IFNγ的影響純化NK細胞、IL-12與IL-18刺激后的NK細胞分泌IFNγ量比較不明顯，組間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。見表 1。

表1 乙型肝炎病毒對NK細胞分泌IFNγ的影響

表1 乙型肝炎病毒對NK細胞分泌IFNγ的影響

組別純化NK細胞IL-12與IL-18刺激后的NK細胞t值P值例數(shù) IFNγ 水平（ng/ml）120 120--9．92±1．35 10．15±1．38 1．305 0．193

2．2 乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ的影響 CpG寡脫氧核酸刺激、皰疹病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ量均明顯高于單純pDC誘導(dǎo)NK細胞分泌IFNγ量，而單純pDC誘導(dǎo)NK細胞分泌IFNγ量又明顯高于乙型肝炎病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ量，組間對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0．05）。 見表2。

表2 乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ的影響

表2 乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ的影響

注：與乙型肝炎病毒刺激相比，#P＜0．05；與單純pDC誘導(dǎo)NK細胞相比，*P＜0．05。

組別單純pDC誘導(dǎo)NK細胞CpG寡脫氧核酸刺激皰疹病毒刺激乙型肝炎病毒刺激例數(shù) IFNγ 水平（ng/ml）120 120 120 120 0．43±0．04#1．22±0．42#*1．34±0．41#*0．21±0．01

2．3 乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞殺傷靶細胞K562的影響 pDC誘導(dǎo)的NK細胞以及乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細胞組的靶細胞K562死亡率均明顯高于純化NK細胞，組間對比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均 P＜0．05）；而 pDC 誘導(dǎo)的NK細胞與乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細胞組的靶細胞K562死亡率相比不明顯，組間對比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0．05）。 見表 3。

表3 乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞殺傷靶細胞K562的影響

表3 乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞殺傷靶細胞K562的影響

注：與純化 NK 細胞相比，*P＜0．05。

組別純化NK細胞pDC誘導(dǎo)的NK細胞乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細胞例數(shù) 靶細胞K562死亡率（%）120 120 120 38．54±3．25 71．52±4．31*70．87±4．28*

3 討論

近年來，隨著相關(guān)研究的逐漸深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒的發(fā)展與臨床轉(zhuǎn)歸均和機體內(nèi)的抗病毒免疫應(yīng)答存在密切相關(guān)[6-8]。其中NK細胞是有異于T淋巴細胞與B淋巴細胞的一種具有直接殺傷靶細胞效應(yīng)的特殊淋巴細胞系，具有明顯的抗感染、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等作用[9-11]。其主要來源于骨髓，并在體內(nèi)所有淋巴細胞中占比約為5%～10%。有研究報道顯示[12-14]，NK細胞發(fā)揮抗病毒作用并不需要特異性抗原的刺激，其中靶細胞表面結(jié)構(gòu)、免疫復(fù)合物以及其他細胞因子均可直接誘發(fā)NK細胞的免疫反應(yīng)，并在短時間內(nèi)達至高峰。NK細胞分泌的最重要細胞因子為IFNγ，其對病毒的復(fù)制具有明顯的抑制作用，且在Th1細胞應(yīng)答和T淋巴細胞毒性反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要作用[15-17]。由此，本文通過研究乙型肝炎病毒對NK細胞免疫活性的影響作用，以期為臨床乙型肝炎病毒感染的防治提供理論依據(jù)。

本文結(jié)果顯示：純化NK細胞、IL-12與IL-18刺激后的NK細胞分泌IFNγ量比較不明顯，這表明了乙型肝炎病毒對NK細胞分泌IFNγ量無明顯影響。然而，CpG寡脫氧核酸刺激、皰疹病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ量均明顯高于單純pDC誘導(dǎo)NK細胞分泌IFNγ量，而單純pDC誘導(dǎo)NK細胞分泌IFNγ量又明顯高于乙型肝炎病毒刺激后的pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ量，這又提示了乙型肝炎病毒對pDC誘導(dǎo)的NK細胞分泌IFNγ量具有明顯的抑制作用。分析原因，筆者認為可能是乙型肝炎病毒通過和細胞接觸或分泌可溶性因子的途徑，進一步發(fā)揮干擾NK細胞功能的作用，而不是通過進入NK細胞內(nèi)的途徑影響其功能。此外，pDC誘導(dǎo)的NK細胞以及乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細胞組的靶細胞K562死亡率均明顯高于純化NK細胞，而pDC誘導(dǎo)的NK細胞與乙型肝炎病毒刺激+pDC誘導(dǎo)的NK細胞組的靶細胞K562死亡率相比不明顯，這表明了純化的NK細胞對562靶細胞的殺傷活性較低，而在與pDC共同培養(yǎng)時，其對562靶細胞的殺傷活性顯著增強，且乙型肝炎病毒對NK細胞的殺傷毒性無明顯影響作用。另外，除了乙型肝炎病毒以外，還有一些病毒同樣具有抑制pDC對NK細胞的免疫誘導(dǎo)作用。其中HIV病毒可通過抑制pDC活化的NK細胞IFNγ分泌水平，而這一機制可能在其感染后的致病機制中發(fā)揮重要作用[18，19]。另有研究報道顯示，人巨細胞病毒感染的pDC對NK細胞的殺傷活性無誘導(dǎo)作用[20，21]。

綜上所述，乙型肝炎病毒對NK細胞的活性無激活作用，且會對pDC誘導(dǎo)活化NK細胞產(chǎn)生抑制作用，從而促進乙型肝炎病毒在機體內(nèi)的持續(xù)復(fù)制，提高患者發(fā)生持續(xù)感染的風(fēng)險。值得臨床重點關(guān)注。