何繼龍，李英滋，韓世寶，滿德恩，郭脈海，戰(zhàn)俊杰，張成林,,*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2.菱花集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)寧 272073）

L-異亮氨酸羥化物——4-羥基異亮氨酸具有血糖濃度依賴的促進(jìn)胰島素分泌特性，以及促進(jìn)脂肪代謝等功能，對(duì)糖尿病具有良好的治療效果[1-4]。同時(shí)，4-羥基異亮氨酸還具有降血脂、保護(hù)肝功能等作用[5-7]，具有廣闊的應(yīng)用前景。目前4-羥基異亮氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)主要采用胡蘆巴種子提取法，然而此方法生產(chǎn)效率低（1 kg胡蘆巴種子僅能提取出150 mg 4-羥基異亮氨酸），致使生產(chǎn)規(guī)模小、產(chǎn)量低，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用[8]。此外，化學(xué)合成法因在生產(chǎn)過(guò)程中使用會(huì)產(chǎn)生乙醛等有毒或易爆物且存在提取收率低等不足，仍停留在研究階段[9-13]。Kodera[13]、Ogawa[14]等在蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）中發(fā)現(xiàn)異亮氨酸羥化酶（isoleucine dioxygenase，IDO），由ido基因編碼，該酶能夠以L-異亮氨酸和α-酮戊二酸為底物特異性催化生成4-羥基異亮氨酸（圖1）。在前期研究中，利用該酶開發(fā)出靜息細(xì)胞法合成4-羥基異亮氨酸，但底物L(fēng)-異亮氨酸和α-酮戊二酸價(jià)格較高致使該方法不利用工業(yè)化生產(chǎn)[15]。Smirnov[12]、Kivero[16]等將異亮氨酸羥化酶編碼基因ido轉(zhuǎn)化至大腸桿菌并在發(fā)酵過(guò)程中添加L-異亮氨酸，實(shí)現(xiàn)前體物添加法合成4-羥基異亮氨酸，然而該方法存在L-異亮氨酸被額外消耗及耗糖高等不足。

圖1 異亮氨酸羥化酶催化生成4-羥基異亮氨酸的反應(yīng)示意圖Fig. 1 Reaction route for IDO-catalyzed synthesis of 4-hydroxyisoleucine

前期研究從蘇云金芽孢桿菌TCCC 11826中克隆出ido基因（Accession No. KC884243）[17]，利用該基因以L-異亮氨酸生產(chǎn)菌Corynebacterium glutamicum YILW-2為出發(fā)菌株[18]，構(gòu)建了4-羥基異亮氨酸生產(chǎn)菌HIL016，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法合成4-羥基異亮氨酸。在HIL016菌株中，采用誘導(dǎo)型質(zhì)粒pXMJ19過(guò)表達(dá)ido基因，然而誘導(dǎo)劑IPTG通常對(duì)菌體細(xì)胞生長(zhǎng)存在抑制作用且因其價(jià)格高昂不利于工業(yè)化生產(chǎn)。針對(duì)該問(wèn)題本研究構(gòu)建組成型表達(dá)質(zhì)粒并考察ido基因組成型過(guò)表達(dá)對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響，在此基礎(chǔ)上利用響應(yīng)面法優(yōu)化該菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

本研究所用4-羥基異亮氨酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒桿菌HIL016（C. glutamicum YILW-2ΔaceAPppc：：PtufPgltA：：Ptuf/pXMJ19-ido）、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α以及質(zhì)粒pXMJ19和pXMJ19-ido均由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 引物

本研究所用引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物Table 1 Primer sequences used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰化蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 7.0～7.5，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min[19]。

LBG培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)中添加5 g/L葡萄糖，pH 7.0～7.5，115 ℃高溫蒸汽滅菌15 min。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，酵母粉5 g/L，(NH4)2SO45 g/L，KH2PO4·3H2O 2 g/L，MnSO4·7H2O 0.6 g/L，玉米漿40 mL/L，豆餅水解液 15 mL/L，pH 6.7～7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L，(NH4)2SO43 g/L，KH2PO4·3H2O 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.6 g/L，MnSO4·7H2O 0.015 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.015 g/L，VB10.001 g/L，谷氨酸3 g/L，酵母粉0.5 g/L，玉米漿30 mL/L，pH 6.7～7.0，115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.1.4 試劑

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、ExTaq DNA聚合酶、RNAiso Plus、primeScriptTMRT、SYBR?Premix Ex Taq? II等 寶生物工程（大連）有限公司；4-羥基異亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；化學(xué)試劑均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

U3000高效液相色譜儀 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；PTC-1148型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司；7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司；PD-10除鹽柱 英國(guó)GE Healthcare公司；ZORBAX Eclipse AAA氨基酸柱美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 組成型表達(dá)質(zhì)粒pXM01的構(gòu)建

根據(jù)質(zhì)粒pXMJ19中阻遏蛋白編碼基因lacI上下游序列設(shè)計(jì)引物px-1和px-2（表1）[20]。以質(zhì)粒pXMJ19為模板，利用引物px-1和px-2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后利用Xho I酶切并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、切膠、回收?；厥债a(chǎn)物經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，利用引物px-3和px-4進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pXM01。

1.3.2 ido基因組成型表達(dá)質(zhì)粒pXM01-ido及菌株HIL017的構(gòu)建

以質(zhì)粒pXMJ19-ido為模板，利用引物ido-1和ido-2擴(kuò)增ido基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后利用BamH I和Hind III雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、切膠、回收后連接至經(jīng)相同酶切的pXM01。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃倒置培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子單菌落，經(jīng)活化后提取質(zhì)粒，分別利用Hind III及BamH I和Hind III進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證，并由蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)定質(zhì)粒中ido序列。將鑒定正確的質(zhì)粒命名為pXM01-ido。

將pXM01-ido轉(zhuǎn)化至不含質(zhì)粒pXMJ19-ido的HIL016感受態(tài)細(xì)胞（2.5 kV，25 μF，200 Ω，1 mm電擊杯），然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LBG固體培養(yǎng)基[21-22]，于32 ℃倒置培養(yǎng)。挑取單菌落活化后提取其質(zhì)粒利用引物ido-3和ido-4進(jìn)行PCR鑒定，將鑒定正確的菌株命名為HIL017。

1.3.3 實(shí)時(shí)定量PCR

根據(jù)ido及谷氨酸棒桿菌C. glutamicum ATCC13032 16S rDNA（內(nèi)參）序列采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)用于實(shí)時(shí)定量PCR的引物（表1）。分別將HIL016和HIL017接種至LBG培養(yǎng)基（含30 μg/mL氯霉素），于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)。對(duì)于HIL016，當(dāng)OD600nm為0.6～0.8時(shí)（2～3 h）添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG。分別于4、8、12、24 h和36 h收集培養(yǎng)物，按照說(shuō)明書提取菌體總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。分別以接種至發(fā)酵培養(yǎng)基（0 h）的含質(zhì)粒pXMJ19的HIL016及含pXM01的HIL017細(xì)胞為對(duì)照。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測(cè)。采用2-ΔΔCt法對(duì)ido的轉(zhuǎn)錄量進(jìn)行分析[23]。

1.3.4 IDO酶活性測(cè)定

按1.3.3節(jié)方法收集培養(yǎng)4、8、12、24 h和36 h的HIL016和HIL017細(xì)胞，重懸于10 mL Tris-HCl緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0），利用超聲破碎儀破碎細(xì)胞。將細(xì)胞破碎物于4 ℃、13 000×g離心30 min后取上清液，然后利用PD-10除鹽柱過(guò)濾除鹽。取上述濾液100 μL加入900 μL含10 mmol/L α-酮戊二酸、10 mmol/L L-異亮氨酸、5 mmol/L FeSO4·7H2O和10 mmol/L抗血酸的Tris-HCl緩沖液（100 mmol/L，pH 7.0），反應(yīng)30 min后測(cè)定利用高效液相色譜儀測(cè)定4-羥基異亮氨酸濃度[8]，以每毫克總蛋白每分鐘催化生成的4-羥基異亮氨酸（nmol/（min·mg））表示IDO比活力。

1.3.5 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取前期研究中對(duì)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量影響較大的9 個(gè)因素（N=9），每個(gè)因素分為高（1）和低（-1）2 個(gè)水平，進(jìn)行PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表2）。按照設(shè)計(jì)方案進(jìn)行12 次試驗(yàn)，響應(yīng)值為4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量，篩選出對(duì)其有顯著影響的因素。

表2 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 2 Factors and levels used for PB experimental design

1.3.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量為響應(yīng)值，利用軟件Design Experts V8.0.6，對(duì)1.3.5節(jié)篩選出的對(duì)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量影響較大的因素玉米漿、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)（表3），按照設(shè)計(jì)方案共進(jìn)行15 次試驗(yàn)。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平Table 3 Factors and levels used for Box-Behnken design

1.3.7 搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將活化后的4-羥基異亮氨酸生產(chǎn)菌株以10%（體積分?jǐn)?shù)，下同）接種量接種至含30 mL種子培養(yǎng)基（含30 μg/mL氯霉素）的500 mL搖瓶中，于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)10～12 h。將種子培養(yǎng)物以10%接種量接種至含30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基（含30 μg/mL氯霉素）的500 mL搖瓶中，以苯酚紅作為pH值指示劑，用氨水維持pH 7.0～7.5，于32 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)48 h[24]。對(duì)于HIL016，當(dāng)OD600nm為0.6～0.8時(shí)添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG。

1.3.8 菌株HIL017中pXM01-ido質(zhì)粒的穩(wěn)定性檢測(cè)

將菌株HIL017于LBG液體培養(yǎng)基傳代，每次傳代培養(yǎng)12 h。取不同傳代次數(shù)的培養(yǎng)物，適當(dāng)稀釋后涂布于LBG固體培養(yǎng)基，于32 ℃倒置培養(yǎng)。挑取100 個(gè)單菌落，分別接種至不含氯霉素和含30 μg/mL氯霉素的LBG固體培養(yǎng)基，于32 ℃倒置培養(yǎng)。按式（1）計(jì)算HIL017中pXM01-ido質(zhì)粒的穩(wěn)定性[25]：

挑取含氯霉素LBG固體培養(yǎng)基中的單菌落活化后按1.3.6節(jié)方法進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量。

1.3.9 氨基酸及生物量檢測(cè)

發(fā)酵結(jié)束后，取1 mL發(fā)酵液，于4 ℃、8 000×g離心5 min后取上清液。經(jīng)2,4-二硝基氟苯衍生后利用高效液相色譜儀測(cè)定4-羥基異亮氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸和賴氨酸濃度。檢測(cè)條件為：ZORBAX Eclipse AAA氨基酸柱，50%乙腈-50 mmol/L醋酸銨二元梯度洗脫。發(fā)酵液經(jīng)離心后，用生理鹽水洗滌菌體沉淀3 次，后用適量生理鹽水重懸。利用分光光度計(jì)測(cè)定其發(fā)酵液OD600nm，根據(jù)公式（2）計(jì)算菌體生物量（以干質(zhì)量計(jì)）：

1.4 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3 個(gè)平行并重復(fù)3 次，利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ido基因組成型表達(dá)質(zhì)粒及菌株的構(gòu)建

pXMJ19為谷氨酸棒桿菌常用表達(dá)質(zhì)粒，該質(zhì)粒含tac啟動(dòng)子和lacO元件，基因的轉(zhuǎn)錄受lacI編碼的LacI蛋白阻遏。按1.3.1節(jié)構(gòu)建lacI缺失的組成型表達(dá)質(zhì)粒pXM01。利用鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2A所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，出現(xiàn)堿基數(shù)約為1 000 bp的條帶，與理論值（1 188 bp）接近；而以pXMJ19為模板擴(kuò)增出堿基數(shù)約為2 000 bp的條帶，與預(yù)期值（2 160 bp）接近，表明lacI成功從pXMJ19敲除。

將基因ido的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按1.3.2節(jié)方法連接至pXM01。將獲得的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證，結(jié)果如圖2B所示，質(zhì)粒經(jīng)單酶切獲得堿基數(shù)約為6 000 bp的條帶，與pXM01（5 635 bp）和ido（723 bp）堿基數(shù)之和接近；質(zhì)粒經(jīng)雙酶切獲得堿基數(shù)分別為5 500 bp和750 bp的條帶，分別與pXM01和ido堿基數(shù)接近，表明ido成功連接至pXM01，即pXM01-ido質(zhì)粒構(gòu)建成功。對(duì)該質(zhì)粒中ido基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，其堿基序列未發(fā)生突變。

將重組質(zhì)粒pXM01-ido轉(zhuǎn)化至HIL016感受態(tài)細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，以不含ido基因的pXM01為對(duì)照。如圖2C所示，以從轉(zhuǎn)化子提取的重組質(zhì)粒為模板擴(kuò)增出堿基數(shù)約為850 bp的片段，而以pXM01為模板擴(kuò)增出堿基數(shù)約為150 bp的片段，與其理論值（分別為848 bp和155 bp）接近，表明pXM01-ido成功轉(zhuǎn)化至HIL016，即HIL017構(gòu)建成功。

圖2 pXM01 PCR鑒定、pXM01-ido酶切鑒定及HIL017 PCR鑒定圖譜Fig. 2 Identification of pXM01, pXM01-ido and HIL017

2.2 菌株HIL016和HIL017的ido基因轉(zhuǎn)錄量及IDO比活力分析

圖3 菌株HIL016和HIL017的ido相對(duì)轉(zhuǎn)錄量及IDO比活力Fig. 3 Transcription level of ido and specific activity of IDO in HIL016 and HIL017

如圖3所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株HIL016和HIL017的ido相對(duì)轉(zhuǎn)錄量及IDO比活力均逐漸提高，24 h后趨于穩(wěn)定。然而4～12 h時(shí)，HIL017的ido相對(duì)轉(zhuǎn)錄量及IDO比活力均高于HIL016，24 h后二者無(wú)顯著差異。表明利用構(gòu)建的阻遏蛋白基因lacI敲除質(zhì)粒pXM01實(shí)現(xiàn)了ido基因的組成型表達(dá)，且該質(zhì)粒更有益于發(fā)酵前期ido基因的過(guò)表達(dá)。

2.3 ido基因組成型過(guò)表達(dá)對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響

表4 菌株HIL016和HIL017搖瓶發(fā)酵主要參數(shù)Table 4 Shake-flask fermentation parameters for HIL016 and HIL017

為考察ido基因組成型過(guò)表達(dá)對(duì)4-羥基異亮氨酸合成的影響，利用HIL017進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以ido基因誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)菌株HIL016為對(duì)照，結(jié)果如表4所示，經(jīng)發(fā)酵48 h HIL017的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量和生物量分別為4.62 g/L和7.95 g/L，較對(duì)照菌株HIL016高19.4%和10.3%。誘導(dǎo)劑IPTG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有一定的抑制作用，與HIL016采用誘導(dǎo)型質(zhì)粒相比，HIL017采用的pXM01質(zhì)粒中阻遏蛋白編碼基因lacI被敲除，無(wú)需誘導(dǎo)即可組成型表達(dá)ido基因，避免了IPTG對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，故其生物量高于HIL016。由表4可知，HIL017的4-羥基異亮氨酸單位菌體產(chǎn)量較HIL016高7.4%，表明組成型表達(dá)ido基因可提高菌株HIL017的4-羥基異亮氨酸合成效率。此外，HIL017的副產(chǎn)物（L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸）生成量均顯著低于HIL016，其原因可能是L-異亮氨酸和L-纈氨酸的合成均需丙酮酸[26]，由于組成型表達(dá)ido基因顯著提高了IDO比活力，使得更多的L-異亮氨酸合成4-羥基異亮氨酸，從而消耗更多的丙酮酸用于合成L-異亮氨酸，故L-纈氨酸生成量降低。L-異亮氨酸和L-賴氨酸均以L-天冬氨酸為前體物[27]，L-異亮氨酸的過(guò)量消耗意味著更多的L-天冬氨酸用于L-異亮氨酸合成，故L-賴氨酸合成量降低。本研究考察了tac啟動(dòng)子組成型表達(dá)ido基因?qū)?-羥基異亮氨酸合成的影響，目前已報(bào)道的用于谷氨酸棒桿菌的組成型啟動(dòng)子包括Ptuf、Psod、PgapA和PCP_2454[28-31]。在后續(xù)研究中，擬利用上述啟動(dòng)子調(diào)控ido基因轉(zhuǎn)錄，以考察其轉(zhuǎn)錄水平與IDO酶活性以及4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量的關(guān)系。

2.4 菌株HIL017中pXM01-ido質(zhì)粒的穩(wěn)定性分析

對(duì)HIL017進(jìn)行傳代并測(cè)定其質(zhì)粒穩(wěn)定性及4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量，如圖4所示，經(jīng)20 次傳代，pXM01-ido的穩(wěn)定性（98.4%）及HIL017的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量（4.61 g/L）未見顯著降低，表明菌株HIL017中pXM01-ido穩(wěn)定性好。

圖4 HIL017中pXM01-ido穩(wěn)定性及4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量Fig. 4 Stability of pXM01-ido and production of 4-hydroxyisoleucine by HIL017

2.5 PB試驗(yàn)結(jié)果

選取KH2PO4·3H2O等9 種成分用量為因素，選用N為9的PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，設(shè)定每個(gè)因素的高水平為低水平的2 倍，進(jìn)行12 次試驗(yàn)，以4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量作為響應(yīng)值，結(jié)果如表5所示。

表5 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 5 PB design with response

利用Design Experts V8.0.6分析軟件對(duì)表5中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得各因素的偏回歸系數(shù)及其顯著性。如表6所示，9 個(gè)因素對(duì)應(yīng)響應(yīng)值影響的顯著性順序?yàn)橛衩诐{＞谷氨酸＞FeSO4·7H2O＞MgSO4·7H2O＞酵母粉＞KH2PO4·3H2O＞VB1＞(NH4)2SO4＞MnSO4·7H2O，F(xiàn)eSO4·7H2O、玉米漿與谷氨酸用量3 個(gè)因素對(duì)4-羥基異亮氨酸的產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）。由其效應(yīng)值可知，F(xiàn)eSO4·7H2O和谷氨酸用量為負(fù)效應(yīng)，說(shuō)明其在高水平時(shí)不利于4-羥基異亮氨酸的合成；而玉米漿為正效應(yīng)，說(shuō)明其在高水平時(shí)有利于4-羥基異亮氨酸的合成。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，在FeSO4·7H2O和谷氨酸高水平基礎(chǔ)上減少其用量，在玉米漿低水平基礎(chǔ)上增加其用量。對(duì)于其他不具顯著影響的因素，正效應(yīng)因素取1水平，負(fù)效應(yīng)因素取-1水平。

表6 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)各因素的回歸系數(shù)及其顯著性Table 6 PB design factors regression coefficients and significance test

2.6 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)因素玉米漿、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量效應(yīng)的大小確定最陡爬坡試驗(yàn)相應(yīng)變化的方向及步長(zhǎng)，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。如表7所示，從第1組到第3組4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量逐漸提高，而從第4組后下降，即第3組為最陡爬坡的拐點(diǎn)。故選擇第3組（玉米漿、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量分別為35 mL/L、3.0 g/L和0.016 g/L）作為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

表7 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 7 Design and result of the steepest ascent tests

2.7 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果如表8所示。利用軟件Design Experts V8.0.6，對(duì)表8的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得到回歸方程為：

Y=5.49+0.12A+0.082B+0.025C+0.068AB-0.037AC+0.018BC-0.37A2-0.14B2-0.03C2

回歸方程的方差分析結(jié)果如表9所示，模型的P值為0.005，說(shuō)明模型的差異性極顯著；相關(guān)系數(shù)R2為0.961 5，表明該模型能夠解釋96.15%的響應(yīng)值變化，校正相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.892 1，即僅有變異6.94%不能由該模型來(lái)解釋，說(shuō)明模型與試驗(yàn)擬合良好；變異系數(shù)為1.5%，證明試驗(yàn)結(jié)果可信度高；失擬項(xiàng)P為0.418（＞0.05），表明該模型失擬不顯著。在模型中，A和A2對(duì)4-羥基異亮氨酸影響極顯著，B和B2對(duì)4-羥基異亮氨酸影響顯著，其余因素對(duì)4-羥基異亮氨酸影響不顯著。

表8 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 8 Box-Behnken design with results

表9 回歸模型的方差分析Table 9 Analysis of variance of regression model

圖5 各因素交互影響4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots for 4-hydroxyisoleucine production influenced by interaction among corn syrup, glutamic acid and FeSO4·7H2O

由圖5可知，F(xiàn)eSO4·7H2O的含量一定時(shí)，隨著培養(yǎng)基中玉米漿和谷氨酸用量的增加，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量先增加后降低，在玉米漿和谷氨酸用量分別為34.1 mL/L和2.98 g/L時(shí)達(dá)到最大值5.57 g/L。當(dāng)谷氨酸用量一定時(shí)，玉米漿和FeSO4·7H2O用量之間的交互作用并不顯著；而當(dāng)玉米漿用量一定時(shí)，谷氨酸和FeSO4·7H2O用量之間的交互作用依然不顯著。通過(guò)Design Experts V8.0.6分析軟件，得到的優(yōu)化結(jié)果為玉米漿34.1 mL/L、谷氨酸2.98 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 7 g/L，4-羥基異亮氨酸的理論值為5.57 g/L。

2.8 優(yōu)化培養(yǎng)基效果驗(yàn)證

利用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以驗(yàn)證模型的有效性。結(jié)果表明，在最佳培養(yǎng)基條件下，經(jīng)48 h搖瓶發(fā)酵，4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量達(dá)到5.53 g/L，與理論值5.57 g/L接近，說(shuō)明該模型能很好地預(yù)測(cè)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量，證明了模型的有效性。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基使得HIL017的4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量較優(yōu)化前提高19.7%。

3 結(jié) 論

構(gòu)建了ido組成型表達(dá)質(zhì)粒pXM01-ido及菌株HIL017，其4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量較ido誘導(dǎo)型過(guò)表達(dá)菌株HIL016高19.4%，生物量和單位菌體產(chǎn)量也顯著提高，表明ido組成型過(guò)表達(dá)效果更佳。通過(guò)PB試驗(yàn)確定了HIL017發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿、谷氨酸和FeSO4·7H2O用量為主要影響因素，利用最陡爬坡試驗(yàn)確定這3 種因素的中心值分別為35 mL/L、3.0 g/L和 0.016 g/L。響應(yīng)面法確定的最優(yōu)用量為玉米漿34.1 mL/L、谷氨酸2.98 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 7 g/L，此時(shí)4-羥基異亮氨酸理論產(chǎn)量為5.57 g/L。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所建模型能很好地預(yù)測(cè)4-羥基異亮氨酸產(chǎn)量，最佳條件下為5.53 g/L，較優(yōu)化前提高19.7%。