葉玲，區(qū)碩俊，，*，岑建斌，李秀英，梁俊發(fā)，曾廣豐

（1.廣州檢驗檢測認(rèn)證集團(tuán)有限公司，國家加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心，廣東 廣州 511447；2.廣東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，廣東 廣州 510623）

氨基甲酸酯類化合物是一類有機(jī)合成的中間體，可進(jìn)行酯交換、加成、縮合等反應(yīng)，在醫(yī)藥、農(nóng)藥、織物整理和樹脂改性等領(lǐng)域，具有較廣闊的應(yīng)用[1]。而氨基甲酸酯類農(nóng)藥由于其高效，分解快，選擇性強(qiáng)等優(yōu)點，在我國農(nóng)業(yè)行業(yè)中有非常廣泛的應(yīng)用[2]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥對作物還具有刺激生長的作用[3]，但氨基甲酸酯同樣存在毒性大，對環(huán)境污染等問題，同時也可導(dǎo)致免疫系統(tǒng)及相關(guān)的疾病，例如過敏反應(yīng)，自身免疫疾病和癌癥[4-5]。隨著消費者對食品質(zhì)量安全意識水平的提高，食品中農(nóng)藥殘留的相關(guān)問題也得到了重視。

對于氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法主要是液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-8]和氣相色譜質(zhì)譜法[9-11]。而高效液相色譜法[12-14]，由于檢出限較低，需要對樣品進(jìn)行衍生，操作繁瑣，重復(fù)性差。高分辨飛行時間質(zhì)譜法具有準(zhǔn)確定性的優(yōu)點，在分析過程中能有效地排除雜質(zhì)的。目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的高分辨飛行時間質(zhì)譜法[15-16]相關(guān)報道較少，本試驗基于分散液液微萃?。╠ispersive liquid-liquid microextraction，DLLME） 技術(shù)，建立了同時新鮮果汁中5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatography-high resolution quadrupole time of flight mass spectrometer，UPLC -Q -TOF -MS）。 在DLLME 前處理下，目標(biāo)物在短時間內(nèi)完成提取，且富集倍數(shù)高，結(jié)合UPLC-TOF-MS 精確測定分子量對化合物進(jìn)行定性定量分析。方法整體高效快速，準(zhǔn)確性高，為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分析測定研究提供了參考方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

1.2 材料與試劑

新鮮水果：廣州市售；5 種氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品：異丙威、甲萘威、克百威、丁硫克百威、抗蚜威（純度大于98%）：上海安譜公司；甲醇、甲酸、乙腈、正丙醇、乙醇、丙酮、異丙醇（色譜純）：美國Thermo Fisher 公司；1-溴-3-甲基-丁烷、1-溴辛烷、溴環(huán)己烷、二氯甲烷、三氯甲烷（均為分析純）：上海安譜公司；氯化鈉：廣州試劑廠；中性氧化鋁（Al-N）、硅膠鍵合十八烷基（C18）、氨丙基粉（NH2）、石墨化炭黑（GCB）、N-丙基乙二胺（PSA）：美國 Agilent 公司；Milli-Q 超純水裝置：美國Millipore 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取5 種氨基甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品各0.100 0 g 于100 mL 棕色具塞容量瓶中，用乙腈定容配制成1 000 mg/L 儲備液。再用乙腈配制成個單標(biāo)濃度為 2.0、10.0、20.0、50.0、100、200 μg/L。

1.3.2 樣品前處理

樣品先過濾備用，準(zhǔn)確稱取5 g 樣品于50 mL 聚四氟乙烯塑料離心管中，加入2 g N-丙基乙二胺（PSA）粉末，渦旋震蕩 10 min，于 10 000 r/min 離心 5 min，轉(zhuǎn)移上清液于15 mL 聚四氟乙烯塑料離心管中，加入3 mL去離子水，0.1 g 氯化鈉，0.2 mL 三氯甲烷，0.1 mL 甲醇，渦旋震蕩5 min，于4 000 r/min 離心10 min，取下層提取液用乙腈定容至0.2 mL，供UPLC-Q-TOF-MS 測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：poroshell-120 EC-C18色譜柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；進(jìn)樣體積：2 μL；流速 0.5 mL/min；柱溫：40 ℃；流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸（B）；梯度洗脫程序：0.0 min～10 min，90%～10%B；10 min～14 min，0%B；14 min～16 min，0 % B；16 min～17 min，90 % B，20 min stop。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧 離子源（electron sprayionization，ESI）和大氣壓化學(xué)電離（atmospheric pressure chemical ionization，APCI）復(fù)合源；APCI 源：連接 AB sciex 公司自動校正系統(tǒng)（CDS），每10 個樣品自動校正一次，校正液流速0.35 mL/min；氣簾氣：40 psi，離子源霧化氣：50 psi，離子源加熱輔助氣：50 psi，離子源溫度：550 ℃，離子源電壓5 500 V。一級TOF-MS 掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：100 Da～1 000Da；數(shù)據(jù)采集時間：100 ms，DP：80 V，CE：10 V；二級 IDA-MS 掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：50 Da～1 000 Da，DP：90 V，CE：25±10 V；高靈敏模式；數(shù)據(jù)采集時間：50 ms；信號閾值：100 cps；IDA 實驗每循環(huán)采集6 次數(shù)據(jù)，動態(tài)背景減法扣除。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有質(zhì)譜數(shù)據(jù)在ABSciex 公司的Analyst TF 1.6軟件采集，數(shù)據(jù)在 PeakView 2.0，MasterView 2.0 和MultiQuant 3.0 等軟件上定性定量處理分析。根據(jù)TOF-MS 和IDA-MS 高分辨質(zhì)譜獲得化合物的準(zhǔn)確分子量，定性定量分析果汁中5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性定量分析依據(jù)

采用UPLC-Q-TOF-MS 液相色譜高分辨質(zhì)譜方法檢測分析5 種氨基甲酸酯，以目標(biāo)物一級母離子的精確質(zhì)量數(shù)、同位素豐度比、二級碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)和色譜保留時間等信息為定性分析依據(jù)，響應(yīng)強(qiáng)度為定量依據(jù)；5 個目標(biāo)化合物的定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)依據(jù)見表1，二級精確分子量質(zhì)譜圖見圖1。

2.2 凈化劑的選擇

由于新鮮的果汁中含有大量的糖和色素，如果在不凈化的情況下進(jìn)行萃取，會導(dǎo)致萃取劑析出量少，加入有機(jī)溶劑后，沉淀物也會影響萃取劑的回收，使整體回收率偏低。試驗比較了Al-N、C18、NH2、GCB、PSA5 種凈化劑的凈化效果。詳細(xì)結(jié)果如圖2。

表1 5 種農(nóng)藥化合物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Mass fragmentation of five carbamate pesticides analyzed by IDA-MS

圖1 5 種氨基甲酸酯的二級精確分子量質(zhì)譜圖Fig.1 Second level precise molecular spectra of five carbamate pesticides

圖2 不同凈化劑凈化效果比較Fig.2 Comparison of purification effects of different purifying agents

其中PSA 的凈化效果最好，凈化后的樣品顏色相對較淺，也較為澄清，使用2 g PSA 凈化，各目標(biāo)物回收率均在85.0%以上，故選取PSA 作為凈化劑。

2.3 萃取劑及分散劑的選擇

試驗分別選取二氯甲烷、1-溴-3-甲基-丁烷、1-溴辛烷、溴環(huán)己烷、三氯甲烷5 種有機(jī)溶劑作為萃取溶劑?？疾斓? 種溶劑提取效果見圖3。

圖3 不同萃取劑提取效果Fig.3 Extraction effect of different extractants

結(jié)果表明，三氯甲烷的提取效率最高。所以，選擇三氯甲烷作為萃取劑做進(jìn)一步研究。分別考察了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、正丙醇和異丙醇作為分散劑對萃取效果的影響。測定結(jié)果表明，選取甲醇為分散劑時的萃取效率最高。

2.4 萃取劑體積選擇

試驗前期考察了提取時間對萃取劑回收體積的影響，詳細(xì)結(jié)果如圖4。

圖4 萃取劑體積對回收率的影響Fig.4 Effect of extractant volume on recovery

結(jié)果表明，振蕩時間越長，離心后下層萃取劑越難析出。在提取時間為5 min 時，三氯甲烷較易析出，且5 種目標(biāo)物的回收率也較高。本試驗分別用50、150、200、250、300 μL 的三氯甲烷進(jìn)行萃取，考察了萃取劑體積對萃取回收率的影響。隨著三氯甲烷體積增大，回收率也增大，而當(dāng)三氯甲烷體積大于200 μL 時，回收率增大已不明顯，所以三氯甲烷200 μL 是最佳萃取體積。

2.5 溶液離子強(qiáng)度的優(yōu)化

在樣品中加入鹽，增加整體的離子強(qiáng)度有利于低極性化合物在有機(jī)相中溶解，同時，使有機(jī)相更容易與水相分離。分別加入 50、100、150、200、250 mg NaCl，以5 種氨基甲酸酯的回收率為考察依據(jù)，詳細(xì)結(jié)果如圖5。

圖5 NaCl 用量對回收率的影響Fig.5 Effect of NaCl dosage on recovery

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NaCl 用量為 100 mg 時，5 種氨基甲酸酯的回收率最高，綜合考慮選取100 mg 為NaCl 最佳用量。

2.6 目標(biāo)物定量分析結(jié)果

樣品中5 種氨基甲酸酯的含量，根據(jù)目標(biāo)化合物的一級TOF-MS 高分辨質(zhì)譜信息進(jìn)行分析。首先利用UPLC-Q-TOF-MS 分析方法獲得目標(biāo)化合物的離子流色譜，5 種目標(biāo)化合物配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成一系列質(zhì)量濃度，獲得目標(biāo)化合物的校正曲線，以及線性范圍；同時以3 倍信噪比和10 倍信噪比為依據(jù)，確定方法的檢測限與定量限。5 種目標(biāo)化合物的高分辨提取離子流圖見圖6。結(jié)果表明，校準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)r 在 0.999 0 以上，檢測限為 0.02 μg/kg～0.05 μg/kg，定量限為 0.05 μg/kg～0.15 μg/kg。相關(guān)參數(shù)見表2。由定量分析結(jié)果可知，本方法檢出限低，靈敏度高，可用于非靶向農(nóng)藥殘留快速篩查。

2.7 回收率及精密度

分別對3 種基質(zhì)中進(jìn)行添加回收回收試驗。每種基質(zhì)添加0.5、1.0、5.0 μg/kg 濃度水平標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗方法進(jìn)行測定，每個濃度水平做6 份平行樣品，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，%）結(jié)果見表3。由表3可知，3 種不同基質(zhì)樣品的平均回收率范圍在84.5 %～97.8%，RSD 范圍在1.28%～6.88%，方法精密度及準(zhǔn)確度良好，可用于農(nóng)藥殘留快速篩查。

圖6 5 種農(nóng)藥的提取離子流色譜圖Fig.6 Extracted ion chromatogram of the 5 pesticides

表2 5 種質(zhì)控農(nóng)藥的校準(zhǔn)曲線、檢測限與定量限Table 2 Analytical performance data of 5 pesticides for linearity of calibration curves，coefficient of determination，limit of dection and limitof quantitation

表3 新鮮果汁中5 種氨基甲酸酯的加標(biāo)回收率（n=6）Table 3 The recoveries of five carbamate pesticides in fresh juice（n=6）

3 結(jié)論

基于DLLME 前處理，建立了DLLME-UPLC-QTOF-MS 法對新鮮果汁中5 種氨基甲酸酯類農(nóng)藥進(jìn)行同時測定。樣品在5 min 內(nèi)完成提取，富集倍數(shù)高。結(jié)合UPLC 進(jìn)行分離，5 種目標(biāo)物在短時間內(nèi)分離，且峰型良好。利用高分辨質(zhì)譜的高靈敏度，對目標(biāo)物的定性定量分析更為精確。方法學(xué)數(shù)據(jù)表明，該方法靈敏度高、重現(xiàn)性好和準(zhǔn)確度高，為氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分析測定研究提供了參考方法。