商云帥，王東，溫紅珊，*

（1.吉林工商學(xué)院糧食學(xué)院，吉林 長春 130507；2.長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130033）

中國林蛙（Rana chensinensis）是兩棲綱無尾目蛙科，林蛙屬，主要生長在中國東北的長白山、松花江及鴨綠江上游森林地區(qū)，此外在河北、河南、山東、四川、山西、陜西和青海等處也有分布。中國林蛙最珍貴的部分是雌性的輸卵管，即林蛙油。林蛙油味甘咸，性平，歸腎、肺經(jīng)，具有“益精補(bǔ)腎、養(yǎng)陰潤肺”之功效，對(duì)于氣血虧損、陰虛體弱、神疲乏力等癥有很好的藥效[1]?；诹滞苡偷乃幱脙r(jià)值，人們研究的熱點(diǎn)也集中在林蛙油成分和功能上，大量研究已經(jīng)證實(shí)了林蛙油中富含糖蛋白、必需氨基酸、多糖、酶等生物活性物質(zhì)，市場(chǎng)上也出現(xiàn)了具有抗氧化、抗衰老、提高免疫力功能的多種林蛙油保健品[2-3]。

有關(guān)林蛙油無機(jī)微量元素的研究報(bào)道很少，常平等[4]采用濕法消解前處理技術(shù)，結(jié)合電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜的儀器分析方法建立了林蛙組織中多種微量元素的分析方法。侯天平等[5]利用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法研究了林蛙皮膚中多種微量元素。付春旺等[6]利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定了黑龍江林蛙中10 種微量元素的含量。吉林長白山中國林蛙油標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19507-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品吉林長白山中國林蛙油》在衛(wèi)生指標(biāo)中規(guī)定了4 種重金屬含量的限量，無機(jī)砷含量≤0.5 mg/kg，鉛含量≤0.5 mg/kg，鎘含量≤0.1 mg/kg，甲基汞含量≤0.5 mg/kg[7]。綜合上述文獻(xiàn)報(bào)道可知，其實(shí)林蛙油中元素含量也是一項(xiàng)重要指標(biāo)，但相關(guān)報(bào)道甚少。本研究采集吉林、遼寧境內(nèi)11 個(gè)地區(qū)林蛙樣本，以林蛙油為研究對(duì)象，考察其無機(jī)元素及重金屬元素含量，建立了成熟可靠的定量分析方法，并運(yùn)用SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了聚類分析，對(duì)試驗(yàn)樣本中元素含量進(jìn)行了整體評(píng)價(jià)，期望為林蛙油質(zhì)量控制提供檢測(cè)依據(jù)，為開發(fā)新型保健食品提供理論支撐，進(jìn)一步提升林蛙的高附加值綜合利用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

原子吸收光譜儀（ZEEnit700）：德國耶拿公司；非色散原子熒光光譜儀（PF6-3）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（NexION350X）：PE公司；微波消解儀（SW-4）：美國利曼公司。

元素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液銅（GBW08615）、鐵（GBW08616）、錳（GBW（E）080157）、鋅（GBW08620）、鉀（GBW（E）080125）、鈉（GBW（E）080127）、鎂（GBW（E）080126）、砷（GBW08611）、汞（GBW08617）、硒（GBW（E）080215）、鉛（GBW08619）、鎘（GBW08612），含量均為1000μg/mL：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。5%硫脲（優(yōu)級(jí)純）+5%抗壞血酸（優(yōu)級(jí)純）溶液，1.5%硼氫化鉀（優(yōu)級(jí)純）+0.5%氫氧化鉀（優(yōu)級(jí)純）溶液，鹽酸、硝酸（優(yōu)級(jí)純）。

1.2 樣品前處理

試驗(yàn)采集吉林和遼寧地區(qū)包括通化、安圖、新賓、撫松、白山、桓仁、磐石、敦化、集安、寬甸、永吉的11 個(gè)地區(qū)林蛙，將林蛙解剖取出林蛙油，40 ℃烘干粉碎后用于試驗(yàn)。樣品采用微波消解前處理技術(shù)，利用火焰原子吸收光譜法測(cè)定 Cu、Mn、Zn、Fe、K、Na、Mg 含量，利用電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定Pb、Cd 含量，利用原子熒光光譜法測(cè)定Hg、As、Se 含量。試驗(yàn)中稱取0.3 g林蛙油樣品置于消解罐中，加入5 mL 濃HNO3，預(yù)反應(yīng)30 min 后于微波消解儀180 ℃消解50 min，用超純水定容至100 mL，同時(shí)做樣品空白。砷、硒測(cè)定時(shí)，每100 mL 溶液中加入5%硫脲+5%抗壞血酸10 mL，濃鹽酸10 mL。

1.3 分析儀器的工作參數(shù)

試驗(yàn)所用火焰原子吸收光譜儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀、原子熒光光譜儀3 種儀器的工作參數(shù)如表1所示。

表1 儀器工作參數(shù)Table 1 Parameters of instrument

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，運(yùn)用SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件利用類平均數(shù)法進(jìn)行聚類分析[8-11]。

2 結(jié)果

2.1 方法的線性關(guān)系

優(yōu)化各元素測(cè)定的儀器參數(shù)后，對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行上機(jī)測(cè)定，得到各元素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍，結(jié)果見表2。

表2 線性方程和線性范圍Table 2 Linear equations and linear range

2.2 精密度試驗(yàn)

將微波消解后的林蛙油樣品（產(chǎn)地：通化），在相同的儀器條件下平行測(cè)定6 次，計(jì)算樣品中各元素的濃度和精密度。結(jié)果顯示，12 種元素的RSD 均小于3%，表明儀器精密度較好，符合分析方法的要求[12]。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將微波消解后的林蛙油樣品（產(chǎn)地：通化），分別放置 0、2、4、8、12、24 h 時(shí)測(cè)定樣品中各元素的濃度并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，12 種元素的RSD 均小于3%，表明這12 種元素在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好[13]。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

將產(chǎn)地為通化的林蛙油樣品做6 次平行試驗(yàn)，測(cè)定6 平行樣品中各元素的濃度并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，12 種元素的RSD 均小于5%，表明本方法重復(fù)性較好[14]。

2.5 加樣回收率試驗(yàn)

將產(chǎn)地為通化的林蛙油樣品做6 次平行試驗(yàn)的同時(shí)做加標(biāo)回收率試驗(yàn)，測(cè)定6 平行樣品加標(biāo)后的濃度值并計(jì)算加標(biāo)回收率和RSD，詳見表3。

表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table 3 Result of revovery tests（n=6）

續(xù)表3 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Continue table 3 Result of revovery tests（n=6）

結(jié)果顯示，12 種元素的平均加標(biāo)回收率在80%～120%之間，方法回收率良好，12 種元素的RSD 均小于5%，符合分析要求。

2.6 樣品中各元素含量測(cè)定

試驗(yàn)測(cè)定了11 個(gè)不同地區(qū)的林蛙油樣本的12 種元素含量結(jié)果如表4所示。

從試驗(yàn)結(jié)果可知，林蛙油中含有豐富的無機(jī)元素，其中 K、Na、Mg 含量最高；Fe、Mn、Zn、Cu 含量次之，在7.4 mg/kg～59.5 mg/kg 之間；Se 含量在 0.38 mg/kg ～0.47 mg/kg 之間。K、Na、Mg 含量均達(dá)到了百分含量級(jí)別，K 含量最高的是白山地區(qū)，為1.48%，最低的是敦化地區(qū)，為0.85 %；Na 含量最高的是通化地區(qū)，為0.6 %，最低的是敦化地區(qū)，為0.11%；Mg 含量最高的是敦化地區(qū)，為0.25%，最低的是寬甸地區(qū)，為0.045%。Fe、Mn、Zn、Cu 含量中，F(xiàn)e 含量最高的是白山地區(qū)，為 59.5 mg/kg，最低的是通化地區(qū)，為27.5 mg/kg；Mn 含量最高的是磐石地區(qū)，為58.0 mg/kg，最低的是通化地區(qū)，為12.2 mg/kg；Zn 含量最高的是敦化地區(qū)，為36.1 mg/kg，最低的是新賓地區(qū)，為8.6 mg/kg；Cu 含量最高的是磐石地區(qū)，為10.3 mg/kg，最低的是新賓地區(qū)，為7.4 mg/kg。分析Pb、Cd、Hg、As 重金屬含量可知，均未超出標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19507-2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品吉林長白山中國林蛙油》規(guī)定的限量值。其中Hg 含量在0.01 mg/kg 左右，未超出規(guī)定值 0.5 mg/kg；As 含量在 0.17 mg/kg ～0.50 mg/kg之間，未超出規(guī)定值0.5 mg/kg；Pb 含量在0.14 mg/kg～0.48 mg/kg 之間，未超出規(guī)定值0.5 mg/kg；Cd 含量在0.061 mg/kg～0.099 mg/kg 之間，未超出規(guī)定值 0.1 mg/kg。

由結(jié)果分析可知，同種元素在不同生長地區(qū)的樣本中含量有一定差異，這可能與林蛙生長的地貌氣候特征有關(guān)，引起差異的最重要原因應(yīng)該是土壤、水源等環(huán)境因素。

表4 林蛙油中無機(jī)元素及重金屬元素含量Table 4 Contents of 12 elements in samples of Oviductus ranae

3 討論

3.1 林蛙油中元素聚類分析

由測(cè)定元素含量結(jié)果可知，某些元素含量較高，為常量級(jí)別，如K、Na、Mg 元素。若直接將高低含量相差較大的元素混在一起識(shí)別分析，常量元素帶來的影響會(huì)比微量元素的大[15]，分析結(jié)果不明顯，如圖1所示，就是12 種元素聚類分析結(jié)果。

為了更加清楚元素的聚類情況，對(duì) Zn、Fe、Cu、Mn、As、Se、Pb、Cd、Hg 這 9 種元素進(jìn)行了單獨(dú)聚類分析，結(jié)果如圖2所示。

分析結(jié)果可知，As、Pb、Cd、Hg、Se、Cu、Zn 聚為一類，Mn、Fe 聚為一類，結(jié)論為含量相近的元素聚為一類。

3.2 林蛙油產(chǎn)地聚類分析

對(duì)11 個(gè)地區(qū)的林蛙油樣本進(jìn)行產(chǎn)地聚類分析，結(jié)果如圖3所示。

圖1 林蛙油中所測(cè)12 種元素聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram of CA for 12 elements in Oviductus ranae

圖3 11 個(gè)地區(qū)林蛙油的聚類分析樹狀圖Fig.3 Dendrogram of CA for oviductus ranae from 11 regions

分析結(jié)果可知，通化、撫松、寬甸、白山為一類，安圖、新賓、桓仁、磐石、集安、永吉為一類，敦化為一類?；旧舷噜彽貐^(qū)有相似的元素含量值，但也有個(gè)別轄區(qū)內(nèi)相鄰采樣點(diǎn)的樣品不能很好的聚集在一起，這可能受地區(qū)、地形、地貌及氣候特征影響。

4 結(jié)論

本研究利用微波消解前處理技術(shù)結(jié)合多種儀器分析手段，建立了林蛙油產(chǎn)品中12 種元素檢測(cè)的定量分析方法。結(jié)果表明，林蛙油中含有豐富的無機(jī)元素，K、Na、Mg 含量最高；Fe、Mn、Zn、Cu、Se 含量次之；林蛙油中重金屬 Pb、Cd、Hg、As 含量較低，均未超出國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的限量值。運(yùn)用SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行元素和產(chǎn)地聚類分析，分析了其含量分布特征。元素聚類分析結(jié)果為 3 類，K、Na、Mg 聚為一類，As、Pb、Cd、Hg、Se、Cu、Zn 聚為一類，Mn、Fe 聚為一類；產(chǎn)地聚類分析結(jié)果為3 類，通化、撫松、寬甸、白山為一類；安圖、新賓、桓仁、磐石、集安、永吉為一類；敦化為一類。結(jié)果表明，林蛙油中各種元素含量存在較大差異，但含量相近或是相鄰地區(qū)的能聚為一類。本研究建立了林蛙油中多種元素的定量分析方法，對(duì)多地區(qū)樣本含量進(jìn)行了聚類分析，期望為林蛙油質(zhì)量控制提供檢測(cè)依據(jù)，為林蛙油系列產(chǎn)品開發(fā)提供了數(shù)據(jù)支撐。