公丕學(xué)，廉貞霞，薛霞，宿書芳，孫珊珊，程志，王駿，劉艷明，*

（1.山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 濟(jì)南 250100；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

黃酒是一種以稻米為原料釀制成的糧食酒，是中國最古老的飲料酒，也是世界三大釀造酒之一。黃酒沒有經(jīng)過蒸餾，酒精含量低于20%[1]。黃酒中主要使用的食品添加劑為焦糖色，種類不同的黃酒呈現(xiàn)出米色、黃褐色或紅棕色，焦糖色是一種被允許廣泛用于食品及飲料中使用的著色劑[2]，在生產(chǎn)氨法焦糖色和亞硫酸銨法焦糖色時(shí)會(huì)產(chǎn)生4-甲基咪唑。研究發(fā)現(xiàn)，4-甲基咪唑能導(dǎo)致動(dòng)物長腫瘤，也有可能給人體帶來致癌風(fēng)險(xiǎn)[3]，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物2B 類致癌物清單中[4]。歐盟食品安全委員會(huì)允許在食物中添加含有4-甲基咪唑的焦糖色素，但每千克不能超過200 mg。我國GB 1886.64-2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑焦糖色》中規(guī)定，4-甲基咪唑在液體食品中含量小于0.02%，與世界衛(wèi)生組織限量要求相同[5]。

黃酒中含有氨基酸、多酚、類黑精、谷胱甘肽等生理活性成分，容易干擾測(cè)定，因此樣品處理中提取凈化是難點(diǎn)[1]。樣品提取、凈化方法主要有溶劑提取QuEchers 法[6]和固相萃取法[7]等。檢測(cè)甲基咪唑的方法有氣相色譜法（gas chromatography，GC）[8-9]、液相色譜法[10-13]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14-16]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[17-21]、拉曼光譜法[22]、酶聯(lián)免疫法[23]、分光光度法[24-25]、電化學(xué)色譜法[26-27]、毛細(xì)管電泳法[28]等。目前，對(duì)于黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑則沒有相關(guān)檢測(cè)方法和數(shù)據(jù)。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法具有液相色譜的高效分離能力和四級(jí)桿質(zhì)譜的定性定量能力，因此液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法被廣泛應(yīng)用于食品有毒有害物質(zhì)的分離分析檢測(cè)。

本試驗(yàn)建立一種定性定量準(zhǔn)確的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，定量評(píng)價(jià)目標(biāo)物及同位素內(nèi)標(biāo)在黃酒中的基質(zhì)效應(yīng)，使用陽離子固相萃取方法對(duì)黃酒進(jìn)行凈化，提取和濃縮2-甲基咪唑及4-甲基咪唑，同時(shí)結(jié)合親水作用色譜（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）的保留模式，對(duì)于黃酒中2-甲基咪唑及4-甲基咪唑達(dá)到完全的色譜分離效果，實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的定性定量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品、4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品、4-甲基咪唑-D6 標(biāo)準(zhǔn)品：德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈、甲酸銨：色譜純，德國Merck 公司；三氯乙酸（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC BEH Amide（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）：美國 Waters 公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀：美國Waters公司；AB SCIEX Triple Quad 5500 三重四極桿質(zhì)譜分析儀[配有電噴霧離子源（electron spray lonization，ESI）及MultiQuant 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)]：美國SCIEX 公司；MS-3旋渦混合器：德國IKA 公司；SB-800DTD 超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18k 高速冷凍離心機(jī)：德國SIGMA 公司；Milli-Q 超純水機(jī)：美國Millipore 公司；N-EVAP-45 溫控氮吹儀：美國 Organomation 公司。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液：分別稱取適量的2-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品和4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液，4 ℃避光貯存。

同位素內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：分別稱取適量的4-甲基咪唑-D6 標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈配成1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)貯備液，4 ℃避光貯存。

系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：準(zhǔn)確移取1 mg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液和1 mg/mL 4-甲基咪唑-D6 標(biāo)準(zhǔn)中間溶液適量，用乙腈-10 mmol/L 甲酸銨溶液（95∶5，體積比）稀釋，配制成 0.1、1、10、20、50、100、500、1 000 ng/mL系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中4-甲基咪唑-D6濃度為10 ng/mL，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 方法

提?。悍Q取2.0 g 黃酒于50 mL 塑料離心管中，加入100 μL 100 ng/mL 同位素內(nèi)標(biāo)工作溶液，加入10 mL 1%三氯乙酸，超聲15 min，8 000 r/min 離心5 min，取出待凈化。

凈化：MCX 固相萃取柱依次用6 mL 甲醇，6 mL水活化，取待凈化溶液上柱，控制流速1 mL/min，待上樣完成后分別用5 mL 2%甲酸淋洗，5 mL 甲醇淋洗，然后用9 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集洗脫液在45 ℃恒溫水浴中氮吹至洗脫液近干，定量加入1.0mL 乙腈-10 mmol/L 甲酸銨溶液（95∶5，體積比）復(fù)溶，超聲溶解，過0.22 μm 有機(jī)濾膜，濾液供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測(cè)定。

1.4.1 色譜條件

色譜柱：BEH HILIC；柱溫：40 ℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：2.0 μL；流動(dòng)相：A：10 mmol/L 甲酸銨，B：乙腈，梯度洗脫程序見表1所示。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；氣簾氣：20.0 L/h，碰撞氣：8 L/h，離子噴霧電壓：5 000 V，離子源溫度：500 ℃，噴霧氣：50 L/h，輔助加熱氣：50 L/h。

表1 流動(dòng)相梯度程序Table 1 Gradient program for mobile phase

1.4.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)

樣品基質(zhì)效應(yīng)的存在明顯影響質(zhì)譜方法定量的準(zhǔn)確性，因此有必要對(duì)建立的質(zhì)譜方法進(jìn)行基質(zhì)效應(yīng)考察。在經(jīng)過樣品前處理后加入標(biāo)樣，通過比較，可以定量評(píng)價(jià)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)。為了評(píng)估黃酒樣品在提取凈化處理后的基質(zhì)效應(yīng)，可以通過比較相同濃度的目標(biāo)物在標(biāo)準(zhǔn)溶液和黃酒處理液中響應(yīng)值?？梢酝ㄟ^公式1計(jì)算：

式中：A 為標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物的峰面積；B 為樣品處理液中分析物的峰面積。

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黃酒樣品中加入與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。如果基質(zhì)效應(yīng)約等于0 %，說明沒有基質(zhì)效應(yīng)；如果基質(zhì)效應(yīng)大于0 %，說明出現(xiàn)了離子抑制效應(yīng)，即基質(zhì)抑制；如果基質(zhì)效應(yīng)小于0 %，說明出現(xiàn)了離子增強(qiáng)效應(yīng)，即基質(zhì)增強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱的優(yōu)化

由于2-甲基咪唑和4-甲基咪唑化合物分子較?。ńY(jié)構(gòu)式見圖1），但極性很大，在樣品中含量范圍較寬，所以如何快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出其含量就成為研究的重點(diǎn)。

圖1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure formula of 2-methimazole and 4-methylimidazole

為了提高試驗(yàn)的靈敏度和準(zhǔn)確度，分別試驗(yàn)了不同類型的固相萃取柱Bond Elut C1（8C18）、Waters OASIS MCX（MCX）、Waters OASIS HLB（HLB）、和 Waters OASIS MAX（MAX）對(duì)2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率，用10 ng/mL 兩種目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液過固相萃取柱得到回收率如圖2所示，結(jié)果表明使用Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱時(shí)回收率最好，因此Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱被用于后續(xù)試驗(yàn)前處理樣品凈化步驟中。

圖2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑通過不同固相萃取柱的回收率Fig.2 The recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazoleon different solid-phase extraction（SPE）columns

2.2 固相萃取柱洗脫條件的優(yōu)化

考察了固相萃取柱洗脫液甲醇中氨水體積分?jǐn)?shù)對(duì)2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的洗脫能力，結(jié)果見圖3。

圖3 洗脫液中氨水比例優(yōu)化Fig.3 Optimization of solid-phase extraction（SPE）condition

在洗脫液中氨水體積分?jǐn)?shù)對(duì)目標(biāo)物洗脫有較大影響，目標(biāo)物回收率隨氨水體積分?jǐn)?shù)增加而增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)達(dá)到5%時(shí)回收率最高，當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)升高時(shí)，回收率略有降低。當(dāng)氨水體積分?jǐn)?shù)為5%時(shí)回收率最高，表明此時(shí)洗脫能力最強(qiáng)，因此選擇體積分?jǐn)?shù)5%氨水作為洗脫溶液。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)結(jié)果分析

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黃酒樣品中加入與標(biāo)準(zhǔn)溶液相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。如果基質(zhì)效應(yīng)約等于0 %，說明沒有基質(zhì)效應(yīng)；如果基質(zhì)效應(yīng)大于0%，說明出現(xiàn)了離子抑制效應(yīng)，即基質(zhì)抑制；如果基質(zhì)效應(yīng)小于0%，說明出現(xiàn)了離子增強(qiáng)效應(yīng)，即基質(zhì)增強(qiáng)。

通過1.4.3 基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)公式計(jì)算黃酒樣品對(duì)目標(biāo)物的基質(zhì)效應(yīng)，200 ng/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的基質(zhì)效應(yīng)分別為52.1%和54.5%，說明黃酒樣品對(duì)目標(biāo)物有抑制，純標(biāo)樣外標(biāo)法定量樣品含量偏差較大，該分析方法不適合選擇外標(biāo)法定量方式。

結(jié)果表明黃酒樣品對(duì)目標(biāo)物有基質(zhì)抑制的作用，因此選擇定量方式為同位素內(nèi)標(biāo)法定量，比外標(biāo)法定量更準(zhǔn)確，建立的方法能對(duì)黃酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑能夠準(zhǔn)確定量。

2.4 色譜分離條件的優(yōu)化

試驗(yàn)中采用ESI+模式，使用易揮發(fā)的甲酸銨流動(dòng)相能提高2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的離子化效率，響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度增加，提高靈敏度，因此在流動(dòng)相中加入10 mmol/L 的甲酸銨，以提高目標(biāo)化合物的離子化效率和改善峰形，故本試驗(yàn)選用乙腈-10 mmol/L 甲酸銨為流動(dòng)相體系。

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 根色譜柱的分離結(jié)果如圖4所示。

圖4 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 種色譜柱分離效果Fig.4 Separation effect of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole on 4 chromatographic columns

通過幾種色譜柱分析結(jié)果可以看出，BEH HILIC色譜柱在分離兩種目標(biāo)化合物時(shí)有較好的分離度和更好的峰形，而兩種化合物在BEH Amide 色譜柱的峰型有明顯拖尾和色譜峰展寬現(xiàn)象，BEH C18和HSS T3色譜柱出峰時(shí)間較早，無法對(duì)兩種化合物進(jìn)行有效分離，無法進(jìn)行定性和定量，故本試驗(yàn)采用BEH HILIC色譜柱進(jìn)行分離檢測(cè)。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分子分子量較小、極性較大，與反相色譜柱中固定相之間的相互作用力較弱，不容易保留，一般會(huì)在流動(dòng)相中使用離子對(duì)試劑來增加目標(biāo)物保留，但是流動(dòng)相中含有離子對(duì)試劑時(shí)在儀器及色譜柱平衡時(shí)間較長，最關(guān)鍵是離子對(duì)試劑進(jìn)入質(zhì)譜后容易造成污染，給質(zhì)譜分析帶來困難。HILIC 模式色譜分離方法能夠?qū)?qiáng)極性分子有較好的保留，所用流動(dòng)相比較簡單，能夠與質(zhì)譜更好兼容，對(duì)2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分離效果更好，靈敏度更高。

2.5 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑均含一個(gè)仲氨基基團(tuán)和一個(gè)叔氨基基團(tuán)，在ESI 源電離下容易獲取H+，形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，因此本試驗(yàn)中選用ESI 源正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)式檢測(cè)。為了使化合物具有較高的靈敏度，在做一級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)，通過優(yōu)化電離源參數(shù)毛細(xì)管電壓和錐孔電壓，使母離子響應(yīng)強(qiáng)度最大；在做二級(jí)質(zhì)譜掃描時(shí)，在碰撞氣和碰撞電壓的作用下能夠使目標(biāo)化合物發(fā)生斷裂或重排，從而產(chǎn)生不同的碎片離子。在碰撞作用下甲基咪唑分別丟失一個(gè)-C2H3和一個(gè)-C3H5N，甲基咪唑分別對(duì)應(yīng)產(chǎn)生m/z 56 和m/z 28的碎片離子。碎片離子分別作為目標(biāo)化合物的定性與定量離子對(duì)，并優(yōu)化各自碰撞電壓，使兩對(duì)子離子響應(yīng)最強(qiáng)。2-甲基咪唑，4-甲基咪唑及同位素內(nèi)標(biāo)物的關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2.6 方法的線性范圍和檢出限

以目標(biāo)化合物豐度較高定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值為縱坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)2-甲基咪唑和4-甲基咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，得出線性回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢出限（以信號(hào)與噪音比值S/N≥3 作為檢出限計(jì)算）等，結(jié)果見表3。標(biāo)準(zhǔn)溶液定性離子色譜圖見圖5，定量離子色譜圖見圖6。

表2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑及同位素內(nèi)標(biāo)關(guān)鍵質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The optimized mass spectrometry（MS）parameters of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole and internal standard（IS）

表3 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑線性方程、線性相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients and limits ofdetection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

圖5 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定性離子（82.9＞28）色譜圖Fig.5 Qualitative ions（82.9 ＞ 28）chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

2.7 方法的回收率和精密度

采用兩種不同類型黃酒樣品，進(jìn)行添加回收率和精密度的試驗(yàn)。黃酒樣品中分別添加10、50、100 μg/kg和500 μg/kg 4 個(gè)濃度水平，按照建立的方法進(jìn)行處理，每個(gè)理論添加水平平行測(cè)定6 次。同時(shí)使用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算，結(jié)果見表4。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率在96.3%～106.0%。每個(gè)添加水平平行測(cè)定6 次，測(cè)定結(jié)果表明相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為 3.5%～6.1%。結(jié)果表明，本試驗(yàn)方法能夠用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

2.8 實(shí)際樣品測(cè)定

用本文建立的方法對(duì)市場(chǎng)上購買的10 批次黃酒樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表5。

圖6 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定量離子色譜圖（82.9＞55.9）Fig.6 Quantitative ion chromatograms（82.9 ＞ 55.9）of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

表4 添加回收率與精密度（n=6）Table 4 Recovery and RSD for the determination of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole（n=6）

表5 黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑檢出情況Table 5 Detection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole in yellow wine

本文首次報(bào)道了黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量，其中2-甲基咪唑含量最高為205.635 μg/kg，4-甲基咪唑含量最高為1 030.012 μg/kg。本次所檢樣品含量均低于所允許使用的最大限量200 mg/kg。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化試驗(yàn)條件，選擇1%三氯乙酸提取，MCX固相萃取柱，能夠提高方法的準(zhǔn)確性及靈敏度，選擇分離效果較好的BEH HILIC 色譜柱，并對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了定量評(píng)價(jià)，建立了穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)稀釋超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的可靠定量分析方法。

本方法具有線性范圍寬，穩(wěn)定性好，定性、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適用于不同類型黃酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的定性確證與定量檢測(cè)，可以為政府監(jiān)管提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)積累。