沈紅祥，徐加兵

（1.江蘇省揚(yáng)州市中醫(yī)院，江蘇 揚(yáng)州 225002； 2.江蘇省泰州市藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300）

咽炎合劑為揚(yáng)州市中醫(yī)院常用中藥制劑（批準(zhǔn)文號(hào)為蘇藥制字Z04001168），由金銀花、桔梗、重樓、天花粉、玄參、烏梅、生甘草7味中藥組方，具有清熱解毒、化痰利咽功效，用于治療急慢性咽喉炎。本研究中參考文獻(xiàn)[1-6]，采用高效液相色譜（HPLC）法同時(shí)測(cè)定咽炎合劑中綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ及重樓皂苷Ⅰ的含量，為全面評(píng)價(jià)和控制咽炎合劑的質(zhì)量提供試驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：Agilent1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；Xplorer型微量移液器（德國(guó)艾本德公司）；GTS型智能超聲清洗機(jī)（廣東固特超聲股份有限公司）；XSE型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

試藥：綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為111871-201706，含量為 96.8%），葫蘆素 B對(duì)照品（批號(hào)為 111945-201301，含量為 96.8%），哈巴俄苷對(duì)照品（批號(hào)為111730-201709，含量為95.9%），重樓皂苷Ⅶ（批號(hào)為111593-201604，含量為94.0%），重樓皂苷Ⅱ（批號(hào)為111591-201604，含量為91.4%），重樓皂苷Ⅰ（批號(hào)為111590-201604，含量為93.6%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；咽炎合劑（揚(yáng)州市中醫(yī)院自制，批號(hào)分別為 20171006，20171015，20171028，規(guī)格為每瓶 250 mL）；乙腈、冰醋酸為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：PhenomenexC18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：0.05% 醋酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min時(shí) 15%B→30%B，10～20 min時(shí) 30%B→42%B，20～34 min時(shí) 42%B→51%B，34～46 min時(shí)51%B→60%B，46～60min時(shí)60%B→80%B）；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm（0～10 min），之后為 210 nm；流速：1 mL／min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

稱取綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ及重樓皂苷Ⅰ對(duì)照品各適量，精密稱定，置容量瓶中，加甲醇溶解并定容，制成各成分質(zhì)量濃度分別為 258.5，69.8，100.6，127.2，105.4，109.1 mg／L 的混合對(duì)照品溶液。精密量取供試品5 mL，水浴蒸干，加甲醇溶解并定容至100 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例和樣品制備工藝制成不含金銀花、天花粉、玄參及重樓4味藥材的陰性對(duì)照品，按供試品溶液配制方法制得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下3種溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，得色譜圖（見圖 1）?？梢?，陰性對(duì)照品溶液色譜在綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ及重樓皂苷Ⅰ出峰處無干擾，表明專屬性較好。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 0.25，0.50，1.00，2.50，5.00，10.00 mL，置 10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容，搖勻。配制成分別含綠原酸 6.462 5，12.925 0，25.850 0，64.625 0，129.250 0，258.500 0 mg／L，葫 蘆 素 B 1.745，3.490，6.980，17.450，34.900，69.800 mg／L，哈巴俄苷 2.515，5.030，10.060，25.150，50.300，100.600 mg／L，重樓皂苷Ⅶ3.18，6.36，12.72，31.8，63.6，127.2 mg／L，重樓皂苷Ⅱ2.635，5.270，10.540，26.350，52.700，105.400 mg／L和重樓皂苷Ⅰ2.727 5，5.455 0，10.910 0，27.275 0，54.550 0，109.100 0 mg／L的系列混合對(duì)照品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸?；貧w方程及線性范圍見表 1。

表1 回歸方程及線性范圍（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取含綠原酸25.85 mg／L、葫蘆素 B 6.98 mg／L、哈巴俄苷 10.06 mg／L、重樓皂苷Ⅶ12.72 mg／L、重樓皂苷Ⅱ10.54 mg／L、重樓皂苷Ⅰ10.91 mg／L的混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果的RSD分別為1.24%，0.96%，1.08%，0.90%，1.23%，0.89%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密量取樣品（批號(hào)為20171028）6份，每份5 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ含量分別為 2.101，0.316，0.415，1.359，0.819，1.856 g／L，RSD分 別 為 1.28% ，1.17% ，1.32% ，1.05%，1.43%，1.26%（n=6），表明方法重復(fù)性好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一樣品（批號(hào)為20171028）供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，室溫下分別于 0，2，4，8，15，24 h 時(shí)進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ峰面積的RSD分別為1.38%，1.17% ，1.42% ，1.36% ，0.68% ，1.33% （n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20171028）1 mL，共 6份，水浴蒸干，加甲醇溶解，置100 mL容量瓶中，加入2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液5 mL，加甲醇定容。經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液10 μL進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表 2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

分別精密量取3批樣品各5 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算樣品含量。結(jié)果綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ平均含量分別為2.108，0.319，0.418，1.355，0.826，1.854 mg／g，RSD分別為0.74，0.63，0.72，0.54，1.19，0.60。

3 討論

咽炎合劑組方中，金銀花主要含有綠原酸等有機(jī)酸類，有清熱解毒、疏散風(fēng)熱、涼血止痢、降血降火、消咽利膈之功效[7][8]221；天花粉主要含有葫蘆素B，功效為清熱瀉火、生津止渴、排膿消腫[9]；玄參有清熱涼血、滋陰降火、解毒散結(jié)功效，哈巴俄苷為玄參及其制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分[8]117；重樓可清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚之功效，常用于疔瘡癰腫、咽喉腫痛、蛇蟲咬傷、跌撲傷痛、驚風(fēng)抽搐，有效成分主要為皂苷類，常以重樓皂苷作為重樓及其制劑的指標(biāo)類成分[8]260。故本試驗(yàn)中選綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ為指標(biāo)進(jìn)行含量測(cè)定。

預(yù)試驗(yàn)中，對(duì)各待測(cè)成分進(jìn)行了全波長(zhǎng)掃描，根據(jù)所得光譜，綜合各成分的最大吸收波長(zhǎng)，確定綠原酸檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm，葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ的檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，并經(jīng)試驗(yàn)證明基線對(duì)各峰無干擾、分離效果良好，特異性強(qiáng)。采用色譜工作站的定時(shí)波長(zhǎng)功能改變檢測(cè)波長(zhǎng)，提高了檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，具有靈敏準(zhǔn)確、方便快速的特點(diǎn)。

選擇流動(dòng)相組成及比例時(shí)，分別對(duì)甲醇-水體系及乙腈-水體系下的色譜系統(tǒng)性能進(jìn)行了考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈-水體系梯度洗脫時(shí)的基線平穩(wěn)性、峰形及分離度均顯著優(yōu)于甲醇-水體系，且可較好地分離6種成分，同時(shí)加入0.05%醋酸溶液使得峰形更優(yōu)。

綜上所述，本研究中建立的HPLC法可同時(shí)測(cè)定咽炎合劑中綠原酸、葫蘆素B、哈巴俄苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅰ的含量，且該方法快速、準(zhǔn)確、重復(fù)性高，可用于咽炎合劑的質(zhì)量控制。