陳錦豪，鄭錦濱，史天一，李天驕，王攀攀，毛 勇，2*，蘇永全，王 軍

(1.廈門大學(xué)海洋與地球?qū)W院，福建 廈門 361102；2.廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

近年來，由于對(duì)蝦集約化養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，過高的養(yǎng)殖密度、過量的投喂、盲目施肥加之增氧能力不足[1]導(dǎo)致大量餌料殘?jiān)凹S便沒有及時(shí)處理而逐漸沉積于池塘底部，從而引起養(yǎng)殖水體日漸富營養(yǎng)化，主要表現(xiàn)為可溶性無機(jī)氮NO3-N、NO2-N等有害氮源的增加，養(yǎng)殖水質(zhì)惡化造成水中有害菌增生，導(dǎo)致養(yǎng)殖病害頻繁爆發(fā)[4]。相關(guān)報(bào)道表明養(yǎng)殖過程中優(yōu)良的水質(zhì)理化條件及健康的微生物群落結(jié)構(gòu)有利于對(duì)蝦的健康生長[5-6]。

微生態(tài)制劑是益生菌的統(tǒng)稱，是可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的活菌制劑[7]。它不但能改善養(yǎng)殖動(dòng)物腸道微生物群落環(huán)境、增強(qiáng)消化酶活力、促進(jìn)生長，還能降低養(yǎng)殖環(huán)境中氨氮、亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的含量，減少養(yǎng)殖生產(chǎn)對(duì)水域環(huán)境造成的污染；同時(shí)，由于具有無毒副作用、無耐藥性、無殘留、生產(chǎn)成本低、應(yīng)用效果顯著等諸多特點(diǎn)，其成為水產(chǎn)養(yǎng)殖中不可替代的改良劑[8-9]。

本研究針對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中有害氮源的主要產(chǎn)生者——?dú)堄囵D料及餌料浸出物，在(28±1)℃下從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中分離篩選能有效降解水體氨氮的芽孢桿菌，同時(shí)，采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選出的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵配方優(yōu)化，挑選低廉高產(chǎn)的培養(yǎng)基配方，以期為微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的實(shí)際應(yīng)用及其在養(yǎng)殖生產(chǎn)中的擴(kuò)培方式提供新的選擇和理論參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

實(shí)驗(yàn)樣品為對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘水樣，于2018年6月采自福建省東山縣茂鑫水產(chǎn)有限公司對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘，養(yǎng)殖對(duì)象為凡納濱對(duì)蝦苗種(Litopenaeusvannamei)，體長(0.60±0.05) cm，采集水溫約28℃。具體采集方法：當(dāng)養(yǎng)殖池塘穩(wěn)定正常水色(茶褐色)時(shí)，于池塘內(nèi)設(shè)置5個(gè)采樣點(diǎn)，用容積為1 L的采水器分別采集水樣(水下約20 cm)，將所采水樣等量混合后取部分水樣于無菌器皿中，不做任何處理直接置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與培養(yǎng)基配制

實(shí)驗(yàn)藥品：葡萄糖、可溶性淀粉、紅糖、木薯粉、牛肉膏、酵母浸出物、胰蛋白胨、蛋白胨、豆粕、氯化銨(以上藥品分別采購于北京索萊寶科技有限公司與江蘇綠蔭生物科技有限公司)。

實(shí)驗(yàn)試劑：革蘭氏染色試劑盒、芽孢染色試劑盒、3%接觸酶試劑盒、葡萄糖發(fā)酵管、木糖發(fā)酵管、甘露醇發(fā)酵管、阿拉伯糖發(fā)酵管、厭氧培養(yǎng)袋、淀粉水解生化管、明膠生化管、pH 5.7生化管、7%氯化鈉生化管、V-P試劑盒、V-P半固體瓊脂、檸檬酸鹽生化管、丙酸鹽生化管、硝酸鹽還原試劑盒、硝酸鹽肉湯、卵磷脂瓊脂平板、溶菌酶生化管、血瓊脂平板(以上試劑均采購于青島海博生物科技有限公司)。

分離培養(yǎng)基：2216E固體培養(yǎng)基(青島海博)，1 L超純水，121℃滅菌20 min后倒平板備用。

純化培養(yǎng)基：2216E液體培養(yǎng)基(青島海博)，1 L超純水，分裝于100 mL錐形瓶，121℃滅菌20 min備用。

對(duì)蝦飼料(廣東恒源飼料)。

飼料濃縮培養(yǎng)基(參照趙坤等[10])：取對(duì)蝦飼料30 g(研成細(xì)粉)，加入1 L冷卻滅菌海水，震蕩混勻后于超凈臺(tái)浸泡48 h。取上清餌料浸出液高速離心2～3次后取上清液，后用隔膜真空泵(天津津騰)于0.45 μm濾膜下抽濾2～3次，調(diào)節(jié)pH 至7.8，分裝于100 mL錐形瓶，121℃滅菌20 min備用。

菌種活化培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，瓊脂粉15 g，1 L超純水，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121℃滅菌20 min后倒平板備用。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，1 L超純水，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，分裝于100 mL錐形瓶，121℃滅菌20 min備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖/紅糖/可溶性淀粉/木薯粉5 g，酵母浸出物/蛋白胨/豆粕/氯化銨10 g，氯化鈉5 g，1 L超純水，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，分裝于100 mL錐形瓶，121℃滅菌20 min備用。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 芽孢桿菌的分離純化

將制備好的樣品接種于5 mL無菌離心管中，搖勻后于90℃恒溫水浴鍋中水浴20 min[11]，盡可能地除去其他微生物。水浴后立刻將水樣稀釋為10-1、10-2、10-3等濃度，各取200 μL水樣采用涂布平板法[12]分別涂布于分離培養(yǎng)基，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑取菌落形態(tài)不同的單菌落于分離培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，重復(fù)3～5次，純化菌株，最后將各菌株接種于純化培養(yǎng)基中，加入30%甘油保種[13]并編號(hào)。

2.2 芽孢桿菌的篩選

芽孢桿菌的篩選參照趙坤等[10]的方法并略作修改，具體如下：取500 μL之前保種的各菌株，接種于裝有3 mL純化培養(yǎng)基的無菌離心管中進(jìn)行菌種活化，將活化后的菌液于90℃恒溫水浴鍋中水浴20 min[11]，水浴后將菌液采用涂布平板法[12]進(jìn)行劃線培養(yǎng)，28℃下培養(yǎng)5 d，挑取單菌落根據(jù)常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[14]中革蘭氏染色及芽孢染色法對(duì)菌株進(jìn)行染色檢測，選取革蘭氏陽性，有芽孢的菌株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 菌株降解氨氮實(shí)驗(yàn)

2.3.1 菌含量測定

將各菌株接種于純化培養(yǎng)基中，28℃活化24 h，用稀釋平板法[12]計(jì)算活化后的菌體含量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 菌株氨氮降解實(shí)驗(yàn)

降解實(shí)驗(yàn)參照趙坤等[10]的方法并略作修改，具體如下：以飼料濃縮培養(yǎng)基作為菌株降解溶液，體積為100 mL，以不加菌的飼料濃縮培養(yǎng)基作為對(duì)照組，篩選的不同菌株作為不同的處理組，每個(gè)處理組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。向各處理組加入初始濃度為1×106cfu/mL[15]的菌液，對(duì)照組與處理組搖床振蕩(28℃，160 r/min)培養(yǎng)，每日定時(shí)取3個(gè)重復(fù)樣并使用多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200 Pro ，瑞士Tecan)進(jìn)行細(xì)菌生長曲線的測定；另取1 mL降解液8 000 r/min離心10 min后取上清，采用氨氮測定儀(原理為納氏試劑比色法)立即測定上清液中總氨氮(TAN)含量，連測6 d(包括初始樣)，根據(jù)所得氨氮濃度計(jì)算出每日各菌株對(duì)氨氮的降解率[100%×(氨氮濃度-初始氨氮濃度/初始氨氮濃度)]，篩選對(duì)氨氮降解效果好的菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

2.4 篩選菌株鑒定

2.4.1 菌株形態(tài)學(xué)生理生化鑒定

菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化特性鑒定參照東秀珠等[14]的方法及我國枯草芽孢桿菌檢測標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 26428—2010)，鑒定項(xiàng)目包括菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、芽孢染色、接觸酶反應(yīng)、葡萄糖發(fā)酵、D-甘露醇發(fā)酵、D-木糖發(fā)酵、L-阿拉伯糖發(fā)酵、厭氧生長、淀粉水解、明膠液化、pH 5.7生長、7%氯化鈉生長、V-P反應(yīng)、檸檬酸鹽利用、丙酸鹽利用、硝酸鹽還原、卵磷脂酶反應(yīng)、溶菌酶耐性、溶血反應(yīng)。

2.4.2 菌株分子鑒定

采用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工)提取菌株DNA作為PCR模板，PCR擴(kuò)增引物參考張歡歡[16]的研究，采用通用引物27F與1492R。PCR反應(yīng)體系包括(25 μL)：2×EasyTag Mix (北京全式金)12.5 μL、滅菌的去離子水(ddH2O)9.5 μL、正向引物(10 μM)1 μL、反向引物(10 μM)1 μL、模板DNA(100～120 ng/μL)1 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 2 min，循環(huán) 35次，72℃ 10 min，16 ℃ 90 min。使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測，將片段大小與預(yù)測相一致的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行16S rDNA測序。

菌株16S rDNA所測序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中利用BLAST進(jìn)行同源性比對(duì)，使用MRGA7.0軟件，運(yùn)用Kimura2-Parameter Distance模型，將比對(duì)所得序列與相關(guān)菌株序列構(gòu)建Neighbor-Joning系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.5 篩選菌株生長曲線測定

菌株生長曲線采用多功能酶標(biāo)儀(Infinite M200 Pro，瑞士Tecan)進(jìn)行測定，將菌株活化后按1%的比例接種于純化培養(yǎng)基，搖床振蕩(28℃，160 r/min)培養(yǎng)36 h，每隔2 h取3個(gè)重復(fù)樣測定OD600值，以平均值繪制菌株生長曲線，確定菌株最佳生長周期[17]。

2.6 篩選菌株發(fā)酵配方的優(yōu)化

2.6.1 菌株活化、種子液制備及發(fā)酵培養(yǎng)

菌株發(fā)酵配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參照鄭強(qiáng)等[18]的方法并在實(shí)驗(yàn)過程中有所改進(jìn)，具體如下：在無菌條件下將菌株接種于菌種活化培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)箱中活化24 h，挑選生長良好的單菌落于菌種活化培養(yǎng)基中劃線培養(yǎng)(28℃，24 h)，重復(fù)2～3次，保證菌種純化。

將活化后的菌株挑單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，恒溫振蕩(28℃，160 r/min)培養(yǎng)24 h。

以種子培養(yǎng)液為出發(fā)培養(yǎng)基，將培養(yǎng)好的種子液以2%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)基以種子培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，將碳源牛肉膏依次替換為葡萄糖/紅糖/可溶性淀粉/木薯粉；將氮源胰蛋白胨依次替換為酵母浸出物/蛋白胨/豆粕/氯化銨；無機(jī)鹽氯化鈉保持不變，共16種配方，每種配方3個(gè)重復(fù)，振蕩培養(yǎng)(28℃，160r/min)48 h。

2.6.2 菌含量測定方法

培養(yǎng)結(jié)束后，采用稀釋平板法[12]計(jì)算每種配方的菌含量，將重復(fù)樣取平均后得出每種配方的含菌數(shù)。

2.7 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0 for Windows軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)和多重比較(LSD、Duncan)對(duì)比分析各處理組之間的差異，當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為各處理組間差異顯著。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 芽孢桿菌的分離純化與篩選

實(shí)驗(yàn)經(jīng)分離純化共獲得6株細(xì)菌，再通過革蘭氏染色、芽孢染色檢測后共篩選出5株芽孢桿菌，分別編號(hào)DS1、DS2、DS3、DS4、DS5。

3.2 芽孢桿菌降解氨氮的能力

將篩選所得芽孢桿菌經(jīng)飼料濃縮培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d，共獲得6 d的數(shù)據(jù)(包括初始樣)，根據(jù)所得氨氮濃度計(jì)算芽孢桿菌對(duì)氨氮的降解率(%)，結(jié)果見表1、表2與圖1。結(jié)合表1、表2數(shù)據(jù)可以看出，5 d后DS1、DS2、DS3、DS4等4株菌對(duì)氨氮沒有任何降解效果，與對(duì)照組相比反而使氨氮濃度有著顯著不同程度的升高，統(tǒng)計(jì)分析表明差異顯著(P<0.05)，尤其是DS4菌株，5 d后氨氮濃度達(dá)到(185.33±6.18)mg/L，相比初始濃度升高了近360%，分析原因可能是菌株沒有利用氨氮的能力或者利用氨氮的能力很弱，導(dǎo)致氨氮的降解量無法抵消菌株利用有機(jī)物所產(chǎn)生的氨氮；菌株DS5在5 d內(nèi)對(duì)氨氮有顯著的降解作用(P<0.05)，在第4天達(dá)到最大氨氮降解率(36.41±0.07)%，且從第3天開始氨氮降解率一直穩(wěn)定在36%左右。由圖1也可看出，隨著菌株DS5的生長，氨氮濃度逐漸降低，菌株在0～2 d期間生長最快，之后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期，生長放緩，氨氮濃度在0～2 d期間降解最快，之后3 d逐漸穩(wěn)定在26 mg/L左右，與最初2 d氨氮濃度差異顯著(P<0.05)，說明菌株DS5具有較強(qiáng)的氨氮降解能力并且具有穩(wěn)定性，因此選擇菌株DS5進(jìn)行后續(xù)鑒定。

表1 不同時(shí)間芽孢桿菌對(duì)氨氮的降解濃度

注：表格中同一類型數(shù)據(jù)帶有不同字母表示數(shù)據(jù)之間相互差異顯著(P<0.05)，含有相同字母表示數(shù)據(jù)之間相互差異不顯著(P>0.05)。以下同此。

Notes：The data of the same type with different letters indicated significant differences in the form between each other(P<0.05)，and with the same letters indicated there was no significant differences in the form between each one(P>0.05).The same as below.

表2 不同時(shí)間芽孢桿菌對(duì)氨氮的降解率

注：帶“-”的數(shù)據(jù)表示所測氨氮濃度低于初始濃度，其余則表示所測氨氮濃度高于初始濃度。

Notes：The data with “-” indicated that the concentration of ammonia nitrogen was lower than the initial concentration，and the rest indicated that the concentration of ammonia nitrogen was higher than the initial concentration.

3.3 篩選菌株鑒定

3.3.1 菌株形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

經(jīng)初步鑒定，菌株DS5為桿狀，有芽孢，于2216E平板上28℃培養(yǎng)2～3 d，菌落呈灰白色、不透明、表面粗糙、扁平、近圓形；菌株生理生化特性見表3，其中，7%氯化鈉生長、V-P反應(yīng)、硝酸鹽還原、D-甘露醇發(fā)酵及丙酸鹽利用等測定結(jié)果均符合國標(biāo)(GB/T 26428—2010)中枯草芽孢桿菌的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。

表3 菌株DS5生理生化特性

注：“+”：陽性反應(yīng)；“-”：陰性反應(yīng)。

Notes：+ was positive reaction，- was negative reaction.

3.3.2 菌株分子鑒定

經(jīng)鑒定，與菌株DS5(16S rDNA測序全長為1 420 bp，已在GenBank中注冊(cè)，登錄號(hào)：MK629979)序列同源性較高的均為芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌，與相關(guān)菌株16S rDNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。如圖所示，菌株DS5與模式菌株枯草芽孢桿菌Bacillussubtilisstrain IAM 12118(NR112116.2)聚為一支，序列相似性達(dá)99%，結(jié)合該菌形態(tài)學(xué)、生理生化特性鑒定，初步將菌株DS5鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3.4 篩選菌株生長曲線

菌株DS5生長曲線如圖3所示，菌株DS5在0～4 h處于生長延滯期，4 h開始進(jìn)入指數(shù)生長期，生長加快，尤其是在6～14 h期間生長最快，直至24 h生長速度放緩，開始進(jìn)入穩(wěn)定期和衰退期。

3.5 篩選菌株發(fā)酵配方優(yōu)化

菌株DS5發(fā)酵配方優(yōu)化結(jié)果見表4。

由表4可見，16種配方組合的菌含量均低于對(duì)照組，差異顯著(P<0.05)，其中，葡萄糖-豆粕組含量最高，達(dá)(7.03±0.30)×1010cfu/mL，葡萄糖-氯化銨組最低，為(2.00±0.41)×104cfu/mL，同一碳源和同一氮源不同組合之間大部分也有差異(P<0.05)，說明不同配方組合對(duì)菌的生長有影響。其中，4種碳源與氯化銨的組合與其他組相比菌含量均較低(P<0.05)，說明在氮源為氯化銨時(shí)，菌株生長較弱。

但值得一提的是，當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)，紅糖-氯化銨組菌含量明顯高于其余3組，達(dá)(3.34±0.19)×109cfu/mL，其余三組菌含量均不超過1×106cfu/mL，說明在氮源為氯化銨時(shí)，紅糖作為碳源的效果要優(yōu)于其他碳源。

表4 不同碳源與氮源組合時(shí)枯草芽孢桿菌數(shù)

4 討論

4.1 芽孢桿菌的分離篩選與氨氮降解實(shí)驗(yàn)

益生菌(Probiotic)作為目前國際對(duì)微生態(tài)制劑分類中重要的一部分，包括芽孢桿菌屬(Bacillus)、乳酸菌屬(Lactobacillus)、光合細(xì)菌(Photosynthetic bacteria)、硝化細(xì)菌(Nitrifying bacteria)等，已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中[19-20]。其中，芽孢桿菌作為最早應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的益生菌[21]，其抗逆性強(qiáng)、繁殖迅速、功能多樣，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中已經(jīng)得到廣泛研究與應(yīng)用[22]。安健等[23]從對(duì)蝦池塘中篩選到一株好氧反硝化細(xì)菌—凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)，并研究了其亞硝酸鹽氮降解性能；Zokaeifar等[24-25]分離到2株能夠顯著降解水體氨氮、亞硝酸鹽的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)；閆法軍等[26]在低溫下從刺參養(yǎng)殖池塘中分離到一株能顯著降解水體氨氮的芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillusspp.)Y11；易弋等[27]從鯉魚(Cyprinidae)、草魚(Ctenopharyngodonidellus)混養(yǎng)池中分離出一株能顯著降解水體氨氮的巨大芽孢桿菌X1，在菌株活化與未活化狀態(tài)下對(duì)氨氮的降解率分別達(dá)97.7%與98.4%；王娟等[28]從凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池中分離出一株巨大芽孢桿菌Zjs05，其可將有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為氨氮，又能將氨氮繼續(xù)降解。可見，芽孢桿菌能夠通過降解水中氨氮含量以凈化水質(zhì)、修復(fù)養(yǎng)殖環(huán)境，從而改善養(yǎng)殖生物的生存環(huán)境，提高養(yǎng)殖生物的生長性能及改善健康狀況。

Ninawe等[22]和Verschuere等[29]研究認(rèn)為從養(yǎng)殖水生環(huán)境中分離的益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果會(huì)更好，Sharifuzzaman等[30]和Zhou等[31]也證實(shí)了從養(yǎng)殖環(huán)境中分離出的益生菌具有良好的益生效果。據(jù)研究[32]，凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)的適宜生長溫度在18～35℃之間，高于35℃或低于18℃均會(huì)影響對(duì)蝦正常生長。綜上，本文選擇在(28±1)℃下從凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中篩選具有能顯著降解水體氨氮能力的“土著”菌，通過革蘭氏染色、芽孢染色，初步篩選出5株芽孢桿菌；再通過氨氮降解實(shí)驗(yàn)篩選出一株能有效降解氨氮的芽孢桿菌DS5，在初始氨氮濃度約為40 mg/L時(shí)(表1)，5 d內(nèi)氨氮降解率最高達(dá)到(36.41±0.07)%且持續(xù)穩(wěn)定在36%左右(表2)，從降解的量來看，略高于高海英等[33]分別從淡水和海水蝦池底泥篩選出的耐鹽芽孢桿菌T301，其在初始氨氮濃度為20 mg/L時(shí)，3 d內(nèi)對(duì)氨氮降解率分別為55.18%和52.00%；低于羅毅志等[34]從淡水養(yǎng)殖環(huán)境分離的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)DSY002-2001，在初始氨氮濃度為100 mg/L時(shí)，24 h內(nèi)該菌氨氮降解率達(dá)35.5%。結(jié)合菌株DS5形態(tài)學(xué)觀察、生理生化指標(biāo)鑒定及其16S rDNA序列所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹，將菌株DS5初步鑒定為枯草芽孢桿菌。

4.2 篩選芽孢桿菌發(fā)酵配方優(yōu)化

碳源和氮源是微生物細(xì)胞和代謝產(chǎn)物的重要營養(yǎng)物質(zhì)，是維持微生物正常生長繁殖的重要成分，也是發(fā)酵培養(yǎng)基的重要組成部分。發(fā)酵培養(yǎng)基配方是影響微生物發(fā)酵的重要因素之一，不同細(xì)菌對(duì)各種營養(yǎng)物質(zhì)的需求量不同[35]。本實(shí)驗(yàn)研究了不同碳源與氮源發(fā)酵培養(yǎng)基配方對(duì)篩選出的枯草芽孢桿菌DS5菌含量的影響，在碳源的研究中，選擇了單糖、二糖及多糖，其對(duì)枯草芽孢桿菌DS5生長影響的綜合排序?yàn)槠咸烟?可溶性淀粉>紅糖>木薯粉；在氮源的研究中，選擇了有機(jī)氮與無機(jī)氮，其對(duì)枯草芽孢桿菌DS5生長影響的綜合排序?yàn)槎蛊?酵母浸出物>蛋白胨>氯化銨。秦艷等[36]研究表明葡萄糖能顯著提高含菌數(shù)，且就效果而言，二糖和單糖優(yōu)于多糖，與本研究結(jié)論略有不同，分析原因可能是菌株的不同導(dǎo)致對(duì)配方的利用效果不同，本實(shí)驗(yàn)中菌株DS5能夠較好地利用可溶性淀粉；此外，實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，除紅糖-氯化銨培養(yǎng)基顏色偏紅外，其余3種碳源與氯化銨組成的培養(yǎng)基顏色均為白色透明，說明有色培養(yǎng)基可能會(huì)對(duì)芽孢桿菌的生長產(chǎn)生影響。

氮源研究結(jié)果表明，有機(jī)氮源對(duì)菌株DS5生長的影響顯著大于無機(jī)氮源，尤其是當(dāng)?shù)礊槎蛊蓵r(shí)的4種配方組合含菌數(shù)均顯著高于各自同一類型下其余氮源配方組合(P<0.05)，這與劉輝等[37]研究發(fā)現(xiàn)一致，表明豆粕是影響芽孢桿菌菌數(shù)生長較為顯著的因素。此外，豆粕雖然營養(yǎng)價(jià)值較高，但存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子[38]，且其影響對(duì)豆粕營養(yǎng)成分的消化、吸收與代謝，又因大豆蛋白分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜[39]、分子量大[40]，導(dǎo)致豆粕中蛋白質(zhì)消化率低，利用困難，造成資源浪費(fèi)[41-43]。研究表明[44-45]，枯草芽孢桿菌能夠降解豆粕中的大分子蛋白質(zhì)和胰蛋白酶抑制劑等抗?fàn)I養(yǎng)因子，提高豆粕生物利用度及營養(yǎng)價(jià)值利用率，實(shí)現(xiàn)其高值化利用，也與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致。另外，值得一提的是，雖然當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)的4種配方組合的菌含量均顯著低于其余各組(P<0.05)，但對(duì)這4種組合單獨(dú)進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果顯示紅糖-氯化銨組顯著高于其他3組，菌含量達(dá)到(3.34±0.19)×109cfu/mL，差異極顯著(P<0.01)。說明當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)，以紅糖作為碳源的效果明顯優(yōu)于其他碳源，分析原因可能是紅糖作為未加工徹底的二糖，含有多種維生素和微量元素，營養(yǎng)物質(zhì)較于其他碳源更豐富，當(dāng)芽孢桿菌無法有效利用所加氮源時(shí)，可以充分利用紅糖中的其他營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長。

在菌株實(shí)際發(fā)酵培養(yǎng)過程中，降低培養(yǎng)基成本，提高單位面積培養(yǎng)液中含菌數(shù)至關(guān)重要。因此，從節(jié)約成本的角度考慮，紅糖價(jià)格比葡萄糖、可溶性淀粉低了近1倍，與木薯粉相近；豆粕價(jià)格比酵母浸出物、蛋白胨低了20～40倍，比氯化銨低了近2倍。從含菌量的角度考慮，紅糖-豆粕培養(yǎng)基雖顯著低于葡萄糖-豆粕、可溶性淀粉-豆粕培養(yǎng)基(P<0.05)，但只低了近1倍，并略高于木薯粉-豆粕培養(yǎng)基。

本文所篩選出的菌株DS5為海生“土著”菌，早已適應(yīng)海水中的生存環(huán)境，而海水中的無機(jī)鹽主要為氯化鈉，故本實(shí)驗(yàn)沒有從無機(jī)鹽的角度進(jìn)行篩選。同時(shí)，氯化鈉與紅糖、豆粕價(jià)格接近，成本較低，因此，綜合成本、含菌數(shù)等指標(biāo)，選擇5‰葡萄糖-10‰豆粕-5‰氯化鈉作為菌株DS5的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方。

5 結(jié)論

本文從對(duì)蝦養(yǎng)殖池塘中分離出一株能夠顯著降解養(yǎng)殖水體氨氮并能持續(xù)保持水體氨氮穩(wěn)定在較低濃度的枯草芽孢桿菌，并研究了其降解規(guī)律，為微生態(tài)制劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中處理氮源污染的實(shí)際應(yīng)用提供新的選擇；同時(shí)，對(duì)該菌發(fā)酵培養(yǎng)的配方進(jìn)行初步探索，綜合考慮成本、含菌數(shù)等，最終篩選出5‰葡萄糖-10‰豆粕-5‰氯化鈉作為該菌的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基配方，為該菌在實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中的擴(kuò)培方式提供一定的理論基礎(chǔ)。