刁立琴 康莉 付釗 高保栓 韓婷 河北省醫(yī)療器械與藥品包裝材料檢驗(yàn)研究院 （河北石家莊 050061）

內(nèi)容提要：目的：比較兩種細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法對(duì)子宮托細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的差異。方法：GB/T14233.2-2005的MTT法和GB/T 16886.5-2017的MTT法。結(jié)果：RGR分別為13%和75%。結(jié)論：細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法的選擇應(yīng)根據(jù)樣品的理化性質(zhì)，模擬臨床的實(shí)際使用情況進(jìn)行選擇。

子宮托是一種Ⅱ類醫(yī)療器械，其材質(zhì)主要為聚乙烯和硅橡膠類。經(jīng)臨床觀察，使用子宮托治療盆腔器官脫垂，可以明顯緩解患者脫垂和排尿相關(guān)癥狀，改善患者的生活質(zhì)量。因其損傷小，操作簡(jiǎn)單，安全有效，在盆腔器官脫垂治療中被廣泛應(yīng)用，近些年又被拓展到壓力性尿失禁、宮頸功能不全和盆底功能障礙等相關(guān)疾病的治療中[1]。隨著我國(guó)人口老齡化的加速，盆底功能障礙患者逐漸增加，子宮托的應(yīng)用將更為廣泛，正確評(píng)價(jià)其安全性尤為重要。

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)具有簡(jiǎn)便、快速、敏感性高的特點(diǎn)，是醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)體系中常用的檢測(cè)指標(biāo)之一，是一種離體狀態(tài)下模擬生物生長(zhǎng)環(huán)境，檢測(cè)醫(yī)療器械產(chǎn)品接觸人體組織后生物學(xué)反應(yīng)的體外試驗(yàn)。本文分別用GB/T14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中的MTT試驗(yàn)方法對(duì)子宮托的細(xì)胞毒性進(jìn)行測(cè)定比較。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗(yàn)樣品：子宮托（來(lái)自生產(chǎn)企業(yè)送樣，材質(zhì)為硅橡膠類）。

細(xì)胞：小鼠成纖維細(xì)胞L-929（中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心）。

主要試劑：1640培養(yǎng)基（北京索萊寶生物科技有限公司），MEM培養(yǎng)基（賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd，DMSO（SIGMA-ALDRICH），異丙醇（天津市百世化工有限公司），ZDBC的聚氨脂膜（Hatano Research Institute，F(xiàn)DSC）。

1.2 方法

1.2.1 GB/T14233.2-2005中MTT試驗(yàn)方法

試驗(yàn)液的制備。①樣品浸提液：取樣品，剪成約1cm×3cm小條，按0.2g/mL的比例，加入含10%血清的1640培養(yǎng)基，37?C浸提24h備用；②空白對(duì)照液：同批含10%血清的1640培養(yǎng)基，同法制備；③陰性對(duì)照液：高密度聚乙烯按0.2g/mL的比例，加入含10%血清的1640培養(yǎng)基，同法制備；④陽(yáng)性對(duì)照：5g/L的苯酚溶液，同法制備。

試驗(yàn)方法。按照GB/T14233.2-2005規(guī)定的MTT試驗(yàn)方法進(jìn)行[2]。將1×104/mL細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，置5%CO2培養(yǎng)箱中37?C培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。分別加入樣品浸提液、空白對(duì)照液、陰性對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液，每孔100μL，置CO2培養(yǎng)箱中37?C培養(yǎng)72h，然后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4h后棄去孔內(nèi)溶液，加入DMSO 150μL，振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm和630nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）。按公式（1）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（RGR）：

表1. MTT法細(xì)胞毒性反應(yīng)分級(jí)(%)

注：RGR——相對(duì)增殖率，%；A——供試品組（陰性組、陽(yáng)性組）吸光度；A0——空白對(duì)照組吸光度。（MTT濃度為5g/L，溶于PBS溶液。）

結(jié)果判定。根據(jù)RGR按表1分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定。陰性對(duì)照組的反應(yīng)不大于1級(jí)，陽(yáng)性對(duì)照組的反應(yīng)至少為3級(jí)時(shí)，判定結(jié)果可靠。

1.2.2 GB/T 16886.5-2017中MTT試驗(yàn)方法

試驗(yàn)液的制備。①樣品浸提液：取樣品，剪成約1cm×3cm小條，按0.2g/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，37?C浸提24h備用；②空白對(duì)照液：同批10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，同法制備；③陰性對(duì)照液：取高密度聚乙烯膜按表面積3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，同法制備；④陽(yáng)性對(duì)照液：取含ZDBC的聚氨脂膜按表面積3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，同法制備。

試驗(yàn)方法。按照GB/T 16886.5-2017規(guī)定的MTT試驗(yàn)方法進(jìn)行[3]。將1×105/mL細(xì)胞懸液接種于96孔板，每孔100μL。置5%CO2培養(yǎng)箱中37?C培養(yǎng)24h后，棄去原培養(yǎng)液。加入樣品浸提液、空白對(duì)照液、陰性對(duì)照液和陽(yáng)性對(duì)照液，每孔100μL置CO2培養(yǎng)箱中37?C培養(yǎng)24h。除去原培養(yǎng)液，每孔加入1g/L的MTT溶液50μL，繼續(xù)培養(yǎng)2h后除去孔內(nèi)MTT溶液，加入100μL異丙醇，振蕩10min，在酶標(biāo)儀570nm和650nm雙波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值）。按公式（2）計(jì)算存活率：

注：OD570e——試驗(yàn)樣品組（陰性、陽(yáng)性對(duì)照組）光密度平均值；OD570b——空白對(duì)照組光密度平均值。（MTT濃度為1g/L，新鮮溶于不含酚紅的MEM溶液。）

結(jié)果判定。當(dāng)細(xì)胞存活率下降到＜空白的70%，則具有潛在的細(xì)胞毒性。

2.結(jié)果

GB/T14233.2-2005MTT法的RGR為13%（見表2），GB/T16886.5-2017MTT法的RGR為75%（見表3），兩者差異明顯。

3.討論

同種樣品的細(xì)胞毒性試驗(yàn)用GB/T 16886.5-2017MTT方法得出的RGR結(jié)果明顯高于GB/T14233.2-2005MTT方法的RGR結(jié)果。分析原因如下。

GB/T14233.2-2005的細(xì)胞接種密度為1×104/mL，而GB/T 16886.5-2017的細(xì)胞接種密度為1×105/mL，兩者相差10倍。同時(shí)鏡下觀察，細(xì)胞形態(tài)均正常，生長(zhǎng)良好。前者細(xì)胞密度稍顯稀疏，后者稍顯致密，考慮接種密度為1×104/mL時(shí)，L929細(xì)胞在24h仍處于緩慢增殖狀態(tài)，會(huì)擴(kuò)大細(xì)胞對(duì)待檢物的反應(yīng)；而接種密度為1×105/mL時(shí)，細(xì)胞在24h后便進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞狀態(tài)較為穩(wěn)定。同時(shí)也有相關(guān)文獻(xiàn)試驗(yàn)證明，細(xì)胞種板數(shù)目增大，細(xì)胞增殖率逐漸增高，這和本試驗(yàn)得出的測(cè)試結(jié)果一致[4]。

GB/T14233.2-2005在浸提液中培養(yǎng)時(shí)間為72h，而GB/T 16886.5-2017在浸提液中培養(yǎng)時(shí)間為24h。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，由于浸提液中硅橡膠聚合物的降解片段會(huì)進(jìn)一步降解，在較小體積中逐漸累積，對(duì)細(xì)胞毒性的影響較為持續(xù)而顯著。

表2. GB/T14233.2-2005MTT法試驗(yàn)結(jié)果

表3. GB/T16886.5-2017MTT法試驗(yàn)結(jié)果

不同的浸提介質(zhì)在浸提樣品時(shí)，在溶液條件下發(fā)生相互作用，因浸提液的成分不同可能也會(huì)導(dǎo)致結(jié)果差異。

GB/T14233.2-2005方法中在加入MTT前沒(méi)有去除浸提液，而GB/T 16886.5-2017方法中則全部去除浸提液后再加入MTT，考慮在浸提液環(huán)境下，樣品浸提析出的成分有可能和MTT反應(yīng)，而影響結(jié)果出現(xiàn)差異。

總之，目前GB/T 16886.5-2017中的MTT法和GB/T14233.2-2005的MTT法作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，被多數(shù)企業(yè)直接引用到評(píng)價(jià)申報(bào)醫(yī)療器械生物安全性，但是并不代表該試驗(yàn)方法適合所有醫(yī)療器械。同時(shí)，體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)條件和臨床實(shí)際使用的環(huán)境條件存在差別，尤其某些降解、溶出的材料應(yīng)謹(jǐn)慎對(duì)待[5]。當(dāng)前醫(yī)療器械產(chǎn)品種類繁多，發(fā)展迅速，如何客觀的評(píng)價(jià)醫(yī)療器械的細(xì)胞毒性，方法的選擇尤為重要，需要全面了解產(chǎn)品的理化性質(zhì)，盡量模擬樣品實(shí)際使用情況或嚴(yán)于樣品實(shí)際使用條件進(jìn)行試驗(yàn)。建議根據(jù)產(chǎn)品材料的不同，選擇適宜的細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法。