南 燕，李 哲，郭鋼花，丁巧方

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，鄭州 450052)

缺血性腦卒中(ischemic stroke)在所有腦卒中發(fā)病率、病死率、復(fù)發(fā)率最高[1-2]，是人類疾病防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。近來有研究表明，腸道菌群紊亂與缺血性腦卒中之間存在一定聯(lián)系，但具體機(jī)制仍不清楚[3-7]，且目前尚無對(duì)缺血性卒中不同時(shí)期腸道菌群的變化特點(diǎn)及其與腸道功能的相關(guān)研究。因此，本研究以缺血性卒中患者及健康對(duì)照者為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)二者糞便標(biāo)本進(jìn)行定性分析，以明確缺血性腦卒中患者不同時(shí)期腸道菌群的變化，進(jìn)而為腦卒中治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年2月至2018年5月期間于本院神經(jīng)內(nèi)科就診的急性缺血性腦卒中患者15例(觀察組)。選擇同時(shí)期本院體檢中心的健康者20例作為對(duì)照組。(1)觀察組納入標(biāo)準(zhǔn)：①診斷標(biāo)準(zhǔn)參照1995年第四次全國腦血管疾病學(xué)術(shù)會(huì)議制訂的診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)頭顱 CT 、MRI或DWI等影像學(xué)檢查診斷明確；②自愿加入并配合該研究，簽署知情同意書；③年齡在40～70歲。(2)對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①無器質(zhì)性疾病及腦血管病相關(guān)病史，無家族史；②本研究所需的實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查(血、尿、糞便常規(guī)，肝腎功能、血脂)正常；③自愿加入并配合該研究，簽署知情同意書；④年齡在40～70歲。(3)觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往或此次發(fā)病存在顱內(nèi)出血、惡性腫瘤、炎癥性腸病等消化系統(tǒng)相關(guān)疾病、其他嚴(yán)重威脅生命的重大疾病(如肝衰竭、腎衰竭、心臟衰竭、呼吸衰竭等)；②3個(gè)月內(nèi)使用過任何抗生素、益生菌或益生元制劑。(4)對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：除需滿足觀察組排除標(biāo)準(zhǔn)外，還需符合，①既往有腦血管疾病病史；②目前存在急性疾病或正在服用藥物。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者均接受神經(jīng)內(nèi)科常規(guī)治療，包括營養(yǎng)神經(jīng)、活血化淤、改善微循環(huán)、降壓降糖等藥物治療；所有患者均為低鹽低脂飲食。

1.2.2標(biāo)本采集 使用專用的糞便收集盒、糞菌DNA保存液收集、保存所有入選者的糞便標(biāo)本，以盡量減少標(biāo)本污染和DNA降解等。所有糞便樣本均及時(shí)凍存于-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.2.3腸道菌群DNA提取、PCR擴(kuò)增及基因測(cè)序 觀察組和對(duì)照組的所有糞便標(biāo)本均統(tǒng)一進(jìn)行腸道菌群DNA提取、PCR擴(kuò)增及利用Illumina MiSeq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行基因測(cè)序。

1.2.4生物學(xué)分析

1.2.4.1操作分類單元(OTUs) 獲取及分類學(xué)分析 在97%相似度下利用Usearch算法，通過聚類操作，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTUs的代表序列，然后將所有優(yōu)化序列比對(duì)至OTUs代表序列，選出與代表序列相似性在97%以上的序列，獲得最終的OTUs代表序列。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)最終OTUs代表序列在門、綱、目、科、屬和種等各個(gè)分類水平進(jìn)行分析，獲得各標(biāo)本的群落組成情況。對(duì)比數(shù)據(jù)庫為Greengene(Release 13.5 http://greengenes.secondgenome.com/)。

1.2.4.2物種多樣性分析 a-多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或者生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性，本研究選擇最能反映物種豐富度和均勻度的香農(nóng)指數(shù)(shannon指數(shù))和辛普森指數(shù)(simpson指數(shù))進(jìn)行分析，然后通過Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行指數(shù)組間差異檢驗(yàn)。P<0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。shannon指數(shù)越高說明樣品中的物種越豐富；simpson指數(shù)越低，說明樣品中的物種越豐富。

1.2.4.3物種差異分析 利用線性判別分析(LEfSe分析)進(jìn)行多級(jí)物種差異判別分析，LEfSe一種用于發(fā)現(xiàn)高維生物標(biāo)識(shí)和揭示基因組特征的軟件。包括基因，代謝和分類，用于區(qū)別兩個(gè)或兩個(gè)以上生物條件(或者是類群)。

2 結(jié) 果

2.1兩組對(duì)象基線資料比較 觀察組中15例患者均提供了急性期的首個(gè)糞便標(biāo)本，因2例患者拒絕再次提供樣本，故有13例患者提供了恢復(fù)期的首個(gè)糞便標(biāo)本，對(duì)照組中20例入選者均提供了體檢當(dāng)天的糞便標(biāo)本。觀察組患者和對(duì)照組的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)等相關(guān)指標(biāo)比較，見表1。

表1 兩組對(duì)象基本信息比較

2.2觀察組患者不同時(shí)期與對(duì)照組的腸道菌群多樣性比較 觀察組患者在急性期及恢復(fù)期的腸道菌群多樣性較對(duì)照組均出現(xiàn)明顯減少(P<0.05)，且觀察恢復(fù)期較急性期腸道菌群多樣性增加(P<0.05)，見圖1。

a：P<0.05，與急性期比較；b：P<0.05，與恢復(fù)期比較

圖1觀察患者不同時(shí)期與對(duì)照組腸道菌群多樣性變化比較

2.3觀察組患者不同時(shí)期與對(duì)照組LEfSe多級(jí)物種差異判別分析 觀察組患者在急性期、恢復(fù)期與對(duì)照組在門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)等不同分類學(xué)水平的LEfSe多級(jí)物種差異判別分析見圖2、3。對(duì)照組的特征性菌群為擬桿菌類(Bacteroides)、柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)；觀察組患者急性期的特征性菌群為普羅威登斯菌屬(Providencia)、顫桿菌克屬(Oscillibacter)，恢復(fù)期的特征性菌群為Providencia、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)。

圖3 觀察組患者恢復(fù)期與對(duì)照組不同分類學(xué)水平LEfSe分析

2.4觀察組患者不同時(shí)期物種組成差異分析 觀察組患者急性期與恢復(fù)期的物種組成差異分析見圖4。采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，在屬水平上未發(fā)現(xiàn)觀察組患者急性期與恢復(fù)期之間存在明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的物種。

圖4 觀察組患者不同時(shí)期物種組成差異分析

3 討 論

近年來，隨著微生物組學(xué)的發(fā)展，腸道菌群與多種疾病之間的關(guān)系成為近年來的研究熱點(diǎn)[8-10]。諸多研究表明腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦卒中、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、帕金森病等之間存在關(guān)系[11]。腦卒中患者及腦卒中后抑郁患者的腸道菌群多樣性及物種組成等方面均會(huì)發(fā)生變化。

3.1腦卒中對(duì)腸道菌群多樣性及物種組成的影響 本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組患者中Faecalibacterium下降，Providencia、Oscillibacter、Ruminococcaceae增加。Faecalibacterium是一種可以產(chǎn)丁酸鹽的抗炎性細(xì)菌，該菌在2型糖尿病、非酒精性脂肪肝、卒中后抑郁等疾病中有下降的現(xiàn)象[12-14]。Providencia可引起消化道感染、泌尿道感染及其他腸道外感染，是引起醫(yī)院感染的常見機(jī)會(huì)性致病菌，也是常見的耐藥菌。缺血性腦卒中后增加的Ruminococcaceae可以使皮質(zhì)醇增高，5-羥色胺表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，有研究對(duì)腸道菌群的基因組學(xué)組成研究亦發(fā)現(xiàn)腦缺血患者的Ruminococcaceae明顯增加[15]。Oscillibacter在卒中后抑郁患者中減少，同時(shí)該菌還與氧化三甲胺(TMAO)水平呈正相關(guān)[14，16]?？傮w來說，腦卒中發(fā)生后，腸道內(nèi)部分有益菌減少，部分機(jī)會(huì)性致病菌增多，且會(huì)持續(xù)相當(dāng)一段時(shí)間，神經(jīng)系統(tǒng)損傷、卒中后抑郁、機(jī)會(huì)性致病菌感染可能與此有關(guān)。

3.2缺血性腦卒中不同時(shí)期的腸道菌群變化特點(diǎn) 缺血性腦卒中急性期與恢復(fù)期的腸道菌群在物種組成上雖無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但通過多樣性分析發(fā)現(xiàn)后者較前者的腸道菌群多樣性有增加的趨勢(shì)，這在一定程度上可以反映出缺血性腦卒中患者腸道功能在恢復(fù)。因此，本課題組推測(cè)隨著各項(xiàng)綜合治療的進(jìn)行及病程的自然進(jìn)展，在患者的臨床癥狀、功能障礙逐漸好轉(zhuǎn)的情況下，患者的腸道菌群多樣性、物種組成及腸道功能有恢復(fù)的可能性，但腸道菌群的恢復(fù)時(shí)間、程度及與患者臨床癥狀好轉(zhuǎn)之間的相關(guān)性等仍有待進(jìn)一步研究。

缺血性腦卒中不同時(shí)期出現(xiàn)的腸道菌群變化可能是腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相互作用的結(jié)果。近年來，新提出的“菌群-腸-腦”軸概念是研究卒中與腸道菌群關(guān)系的前提假設(shè)[17]，目前認(rèn)為腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間可能通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、迷走神經(jīng)3條途徑相互作用[18-20]，這3種途徑之間相互影響，相互作用，實(shí)現(xiàn)腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交流。此外，腸道菌群還可直接或間接影響高血壓、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化等腦卒中危險(xiǎn)因素，從而對(duì)腦卒中的發(fā)生及預(yù)后產(chǎn)生影響[21-22]。PONFERRADA等[23]研究發(fā)現(xiàn)，大腦缺血作為一種應(yīng)激，可導(dǎo)致細(xì)菌移位，同時(shí)，細(xì)菌移位會(huì)增加梗死面積，給卒中結(jié)局帶來不良影響[24]，此外有研究表明糞菌移植可以明顯改善卒中預(yù)后[25]，這些研究都說明缺血性腦卒中與腸道菌群之間存在相互影響。

通過本研究推測(cè)，正是由于上述復(fù)雜的作用機(jī)制，才形成了缺血性腦卒中不同時(shí)期腸道菌群的變化特點(diǎn)。隨著缺血性腦卒中臨床癥狀的好轉(zhuǎn)及梗死灶的軟化，腸道菌群亦有恢復(fù)的可能性，二者之間相輔相成，互相影響，這也印證了“菌群-腸-腦”軸存在的可能性。

本研究仍存在一些不足，未能對(duì)缺血性腦卒中更遠(yuǎn)期與腸道菌群的關(guān)系進(jìn)行研究，需擴(kuò)大樣本量、延長觀察時(shí)間，希望能夠找出腦卒中時(shí)期具有代表性的腸道菌群，進(jìn)而更具針對(duì)性的補(bǔ)充益生菌，為腦卒中的治療提供新的靶點(diǎn)。