劉瓊?cè)悖S秀芳，梁津杰，方曉華，蔡育波，楊文麗，黃 輝，陳艷虹，陳仙蘭，張 鑫,2，林碧華

(1.廣東省江門市中心醫(yī)院病理科 529030；2.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；3.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，廣東東莞 523808)

胃癌(gastric carcinoma)是常見的消化道惡性腫瘤，其中胃腺癌最為常見，可占85%以上。我國(guó)的胃癌發(fā)病率一直較高，從2004年后便居于發(fā)病癌譜的第二位[1]。2015年我國(guó)新發(fā)胃癌患者估算為67.9萬，其中男性47.8萬、女性20.1萬，同期因胃癌死亡的患者約為49.8萬，其中男性33.9萬、女性15.9萬[2]。相比之下，2012年世界范圍內(nèi)新發(fā)胃癌病例約95.1萬，其中男性63.1萬、女性32.0萬；同期因胃癌致死患者約72.3萬，其中男性46.9萬、女性25.4萬[3]。粗略統(tǒng)計(jì)可知世界新發(fā)胃癌的患者，一半以上位于我國(guó)，較為精確的流行病學(xué)研究顯示，包括我國(guó)在內(nèi)的東亞地區(qū)是胃癌的第一高發(fā)區(qū),發(fā)病率約為24.6/10萬人，其男性約35.4/10萬人，女性約13.8/10萬人，遠(yuǎn)高于世界平均發(fā)病率的7.5/10萬人，其中男性約9.8/10萬人、女性約5.1/10萬人[3]?？梢娢覈?guó)胃癌防治的嚴(yán)峻，因此更應(yīng)深入研究胃癌的發(fā)病相關(guān)機(jī)制，尋找更為有效的診斷標(biāo)記物及潛在的治療靶點(diǎn)。

由于早期癥狀不典型，普查不及時(shí)，目前在我國(guó)早期胃癌的診斷率不足10%，有65%～70%的胃癌患者在就診時(shí)已經(jīng)達(dá)到中晚期，5年生存率較低，僅為27.4%，因此化療和靶向治療在胃癌治療中起關(guān)鍵作用[4]。臨床中胃癌除了診斷和鑒別診斷相關(guān)的免疫標(biāo)志物外，還有如人類表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR2)、表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)和MET原癌基因受體(MET proto-oncogene-receptor tyrosine kinase,MET)等治療靶點(diǎn)相關(guān)標(biāo)志物；雖然與胃癌患者化療及預(yù)后相關(guān)的標(biāo)志物有Ki-67、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因(excision repair cross-complementing 1,ERCC1)等，但缺少統(tǒng)一的判讀標(biāo)準(zhǔn)，且局限于蛋白表達(dá)水平[5]。因此，本課題組將嘗試?yán)萌蚪M拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNV)分析的方法，在癌癥基因組圖譜計(jì)劃數(shù)據(jù)庫(kù)(The Cancer Genome Atlas,TCGA,https://gdc-portal.nci.nih.gov/)中嘗試鑒別出于胃癌患者化療抵抗相關(guān)的基因。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集整理2008年1月到2013年12月在江門市中心醫(yī)院就診的胃癌患者信息，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)有手術(shù)標(biāo)本，采用改良的D2根治術(shù)；(2)有術(shù)后化療記錄，化療周期不超過6個(gè)月；(3)有2年定期隨訪檢查記錄，能明確判斷復(fù)發(fā)進(jìn)展?fàn)顩r。共納入64例胃癌患者，其中21例患者2年內(nèi)的隨訪檢查有復(fù)發(fā)進(jìn)展?fàn)顩r，其余43例患者2年內(nèi)無復(fù)發(fā)進(jìn)展事件。TCGA與江門市中心醫(yī)院胃癌患者的一般信息，見表1。

表1 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的基本信息[n(%)]

1.2方法

1.2.1TCGA胃癌的全基因組CNV分析 參照文獻(xiàn)[6]報(bào)道，利用開放軟件TCGA簡(jiǎn)易下載工具V9.2(http://www.shengxin.ren/article/95)，下載TCGA中胃癌的基因組拷貝信息及對(duì)應(yīng)樣品的臨床信息，數(shù)據(jù)庫(kù)的更新下載日期為2018年5月31日，其中總病例數(shù)為443例，具有詳細(xì)化療藥物使用信息的有135例，具有詳細(xì)化療藥物使用信息和全基因拷貝信息的有121例，具有生存預(yù)后信息及全基因拷貝信息的有441例。參考文獻(xiàn)[6-9]報(bào)道，在GenePattern公共服務(wù)器平臺(tái)(https://genepattern.broadinstitute.org/)上，利用GISTIC 2.0軟件分析全基因組拷貝信息。

1.2.2熒光定量PCR檢測(cè)石蠟標(biāo)本的基因組CNV 調(diào)取患者手術(shù)標(biāo)本中腫瘤成分70%的石蠟組織，10 μm厚度切片4張。利用GeneRead DNA FFPE Kit按操作說明書提取石蠟切片的DNA；利用TaqMan Copy Number Assay的熒光定量PCR引物Hs00585301_cn、Hs02658328_cn和Hs02774936_cn別檢測(cè)ELP2、STAT3和SETD2基因組拷貝數(shù)，其中內(nèi)參引物為TaqMan Copy Number Reference Assay RNase P，二倍體參考樣品為健康人血漿白膜層樣品，擴(kuò)增試劑盒為TaqMan Fast Advanced Master Mix，按說明書在CFX96熒光定量PCR儀中檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[10]標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定樣品中目標(biāo)基因的相對(duì)拷貝數(shù)檢測(cè)值小于0.75為缺失(Deletion)，>1.50為擴(kuò)增(Gain)，其余為二倍體(Diploid)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel2010及GraphPadPrism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)表示，各組間頻數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用χ2檢驗(yàn)或Fisher′s精確檢驗(yàn)，生存分析使用Kaplan-Meier分析方法及l(fā)og-rank檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌化療用藥情況分析 通過分析TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌患者的臨床用藥信息，分別得到135例及64例患者記錄了詳細(xì)的化療藥物使用信息，其所用藥物及分布，見表2，從表中數(shù)據(jù)可知氟尿嘧啶+鉑類是胃癌患者最常用的化療方案。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的135例患者中，有81例治療后呈完全緩解(complete response,CR)，3例為部分緩解(partial response,PR)，10例為病情穩(wěn)定(stable disease,SD)，41例為病情進(jìn)展(progressive disease,PD)。將呈CR的患者定義為化療敏感(chemotherapy sensitivity,CS)，而PD的患者定義為化療抵抗(chemotherapy resistant,CR)。在該院64例患者中，將21例患者2年內(nèi)的隨訪檢查有復(fù)發(fā)進(jìn)展?fàn)顩r定義為CR，其余43例患者2年內(nèi)無復(fù)發(fā)進(jìn)展事件定義為CS。

2.2TCGA胃癌化療反應(yīng)相關(guān)的全基因組拷貝數(shù)分析 GISTIC 2.0分析顯示，18q12.2和17q21.2區(qū)段特異性在化療抵抗患者腫瘤組織中擴(kuò)增，3p21.31區(qū)段特異性在化療抵抗患者腫瘤組織中缺失，見圖1、2。

表2 TCGA及江門市中心醫(yī)院胃癌化療用藥情況

圖2 胃癌腫瘤組織中全基因組缺失情況

2.3TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV與化療反應(yīng)相關(guān)性 利用GISTIC 2.0軟件明確18q12.2、17q21.2和3p21.31的基因組CNV熱點(diǎn)基因分別為乙酰基轉(zhuǎn)移酶延伸因子復(fù)合物亞基2(elongator acetyltransferase complex subunit 2,ELP2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SETD2(histone-lysine n-methyltransferase 2,SETD2)；結(jié)果顯示，ELP2和STAT3的擴(kuò)增及SETD2的缺失均與胃癌化療抵抗相關(guān)(P<0.05)。綜合3個(gè)基因的CNV情況，可知CR患者中有其中1個(gè)指標(biāo)陽性為24例，3個(gè)指標(biāo)均陰性為17例；CS患者中，有其中1個(gè)指標(biāo)陽性為17例，3個(gè)指標(biāo)均陰性為63例，兩組患者3個(gè)基因的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中患者ELP2/STAT3/SETD2的基因拷貝數(shù)情況與化療反應(yīng)間相關(guān)性分析[n(%)]

表4 江門市中心醫(yī)院患者ELP2/STAT3/SETD2的基因組拷貝數(shù)與化療反應(yīng)間相關(guān)性分析[n(%)]

2.4TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV與患者預(yù)后相關(guān)性 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中患者的預(yù)后情況，以ELP2/STAT3/SETD2的基因組拷貝數(shù)作為分組，將患者分為3個(gè)指標(biāo)任意1個(gè)指標(biāo)陽性組(P組)及陰性組(N組)。陽性組患者的總生存時(shí)間(OS)、無進(jìn)展生存時(shí)間(RFS)均明顯短于陰性組(21.7、14.2個(gè)月vs. 34.8、17.9個(gè)月)，且兩組患者生存曲線比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A：胃癌患者OS曲線；B：胃癌患者RFS曲線

圖3 TCGA胃癌患者生存預(yù)后情況

2.5江門市中心醫(yī)院患者ELP2/STAT3/SETD2的CNV與化療反應(yīng)相關(guān)性 利用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)64例患者腫瘤組織中ELP2/STAT3/SETD2的基因組拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，ELP2和STAT3的擴(kuò)增及SETD2的缺失均與胃癌化療抵抗相關(guān)(P<0.05)。綜合3個(gè)基因的CNV情況，CR患者中1個(gè)指標(biāo)陽性為14例，3個(gè)指標(biāo)均陰性為7例；CS患者中1個(gè)指標(biāo)陽性為9例，3個(gè)指標(biāo)均陰性為34例，兩組患者3個(gè)基因的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

3 討 論

本研究利用基因組CNV分析的方法，發(fā)現(xiàn)18q12.2區(qū)段、17q21.2區(qū)段在TCGA化療抵抗樣品中特異性擴(kuò)增而3p21.31區(qū)段則缺失，并明確18q12.2、17q21.2和3p21.31的基因組CNV熱點(diǎn)基因分別為ELP2、STAT3和SETD2，進(jìn)一步利用江門市中心醫(yī)院的胃癌臨床標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，明確了ELP2和STAT3的擴(kuò)增及SETD2的缺失均與胃癌化療抵抗明顯相關(guān)(P<0.05)。

組蛋白修飾調(diào)控因子(如乙?；腿ヒ阴；?，甲基化和去甲基化酶等)是表觀遺傳調(diào)控的重要組成，其異常激活或失活經(jīng)常導(dǎo)致人類的各種疾病尤其是癌癥的發(fā)生。ELP2是延伸體(elongator)復(fù)合物的主要亞基，延伸體具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，廣泛參與了RNA聚合酶Ⅱ介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄延伸、RNA修飾、細(xì)胞分裂、細(xì)胞骨架構(gòu)建等細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵調(diào)控過程，在真核生物中高度保守。有研究發(fā)現(xiàn)，ELP2具有兩個(gè)七葉的含WD40結(jié)構(gòu)域的 螺旋槳結(jié)構(gòu)，并通過WD40折疊的完整性與ELP1和ELP3亞基結(jié)合，實(shí)現(xiàn)延伸體的裝配，此外ELP2發(fā)生突變會(huì)明顯影響延伸體的組蛋白H3乙酰化活性[11]，表明ELP2是延伸體行使功能的必要組分，也是復(fù)合體形成的樞紐。

雖然ELP2在癌癥中的研究較少，但有研究發(fā)現(xiàn)，ELP2與STAT3有相互作用，參與了STAT3的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及STAT3信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[12]，而本研究發(fā)現(xiàn)，STAT3的擴(kuò)增與胃癌的化療抵抗明顯相關(guān)(P<0.05)。國(guó)外有研究已經(jīng)明確STAT3的激活在胃癌發(fā)生、發(fā)展中密切相關(guān)，抑制STAT3能增加化療藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的殺傷[13]。雖然激活STAT3的信號(hào)通路很多，但是利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)判斷STAT3激活狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn)難以統(tǒng)一，而本研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌化療的患者腫瘤組織中，ELP2和STAT3在基因組水平就存在拷貝數(shù)擴(kuò)增的情況。相比免疫組織化學(xué)評(píng)價(jià)STAT3的激活情況，利用原位雜交或PCR技術(shù)則更容易實(shí)踐及統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)的研究會(huì)是本課題后續(xù)努力的方向。

除了ELP2介導(dǎo)的組蛋白H3乙酰化，組蛋白H3第36位賴氨酸(H3K36)還能夠被多種甲基化酶修飾，其中SETD2能夠在H3K36位點(diǎn)上產(chǎn)生三甲基化修飾(H3K36me3)，在轉(zhuǎn)錄延伸，RNA剪接和DNA損傷修復(fù)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用[14]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，SETD2在結(jié)直腸癌[14]、胃腸道間質(zhì)瘤[15]、透明細(xì)胞腎癌[16]等多種惡性腫瘤中起抑癌作用，而SETD2缺失可能通過改變極性蛋白2(dishevelled segment polarity protein 2,DVL2)轉(zhuǎn)錄時(shí)的內(nèi)含子剪切過程，引起DVL2的mRNA降解，激活Wnt信號(hào)通路，促進(jìn)了結(jié)直腸癌的癌變過程[14]。最近研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中SETD2的表達(dá)下調(diào)，且SETD2的低表達(dá)與患者差的預(yù)后相關(guān)，過表達(dá)SETD2能抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲[17]，表明SETD2在胃癌中也是重要的抑癌基因。

雖然未見SETD2與ELP2及STAT3相互作用的報(bào)道，但是SETD2與ELP2同樣屬于組蛋白修飾調(diào)控因子，SETD2起甲基化修飾，而ELP2起乙?；揎棥Ｔ诨蜣D(zhuǎn)錄的過程中，組蛋白的H3K36去甲基化及H3K27乙酰化的修飾，是轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的特征標(biāo)志[18]，是否SETD2的缺失及ELP2的擴(kuò)增對(duì)STAT3啟動(dòng)靶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起協(xié)調(diào)作用，這值得本課題組進(jìn)一步探索。