王 恒，吉楊丹，王燕林，黨榮敏，余躍生，沈祥春

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州都勻 558003；2.貴州醫(yī)科大學(xué)天然藥物資源優(yōu)效利用重點實驗室，貴陽 550025)

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNJ)是臨床上的常見疾病，其發(fā)生與周圍神經(jīng)干或其分支受到外界直接或間接力量作用損傷有關(guān)，因具有病程長、損害大、治療困難等特點[1]，受損后的神經(jīng)修復(fù)與再生過程復(fù)雜，目前西藥治療PNJ療效局限[2]。民族藥中含有的治療PNJ藥物，因其具有療效確切、不良反應(yīng)小、多靶點作用等優(yōu)點，近年來倍受國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注。黑骨藤為蘿藦科，杠柳屬植物黑龍骨的干燥根或全株，具有活絡(luò)、通經(jīng)、祛風(fēng)、解毒等藥效。苗族藥名為蛙莽塞，是貴州苗族地區(qū)民間廣泛用于閉合性軟組織損傷、風(fēng)濕與類風(fēng)濕等疾病的民族藥，有“萬藤之王”之美譽[3]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，黑骨藤具有抗急性痛風(fēng)作用及修復(fù)線蟲因熱刺激引起的神經(jīng)損傷，對神經(jīng)疼痛治療和修復(fù)神經(jīng)損傷有一定療效[4-5]。因此本研究建立大鼠坐骨神經(jīng)夾持損傷模型，檢測黑骨藤對大鼠坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(sciatic functional index，SFI)及大鼠血清中炎性細胞因子表達的影響，探討黑骨藤對坐骨神經(jīng)損傷(sciatic nerve injury，SNI)的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 健康清潔級SD大鼠120只，雄性，體質(zhì)量280～320 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供。動物合格證號SCXK(黔) 2012-0001。實驗前置于室溫18～22 ℃，相對濕度65%，光照周期12 h，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。

1.1.2主要儀器與設(shè)備 R-210型旋轉(zhuǎn)蒸器購自瑞士BUCHI公司，電爐、電熱恒溫水浴鍋購自上海越進醫(yī)療器械一廠，DZF-4型真空干燥箱購自上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠，TDL-4ZB型臺式低速離心機購自湖南星科科學(xué)儀器廠，DG530酶聯(lián)免疫檢測儀購自華東電子集團醫(yī)療裝備有限公司，KJ-210A型振蕩器購自姜堰康健醫(yī)療器具有限公司，TS-100型搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，BS223型電子天平購自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.1.3藥物與試劑 黑骨藤飲片購于貴州同濟堂制藥有限公司(由貴州醫(yī)科大學(xué)龍慶德副教授鑒定為西南杠柳黑骨藤的全株)，70%乙醇提取，提取率1.45%。白細胞介素(IL)-1、IL-6及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA檢測試劑盒批號為201611，均為武漢基因美生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1SNI模型建立及給藥 120只SD大鼠分為4組，分別為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、黑骨藤10 mg/kg組(C組)、黑骨藤20 mg/kg組(D組)，每組30只。B、C、D組大鼠均行SNI手術(shù)：10%的水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定于手術(shù)板(俯臥位)。消毒右股后部皮膚，剪刀剪一縱行切口(約1 cm)，暴露并游離坐骨神經(jīng)。在脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)分離處用止血鉗夾閉(30 s)，造成神經(jīng)擠壓傷。用11-0無損傷縫線，固定于神經(jīng)外膜作為標記。此時大鼠小腿及足完全癱瘓，展爪反射完全消失，則示造模成功[6]。A組暴露并游離坐骨神經(jīng)但不夾閉，縫合皮膚。術(shù)后C、D組大鼠每天分別給予10、20 mg/kg黑骨藤乙醇提取物灌胃，A、B組均用等體積的生理鹽水灌胃，灌胃容積均為20 mL/kg。各組均在術(shù)后第7、14、28天取材，每次10只。4組大鼠均用適量青霉素粉劑置傷口內(nèi)預(yù)防感染。

1.2.2SFI測定[7]自制行走箱通道(長42.00 cm、寬14.35 cm)，等長、等寬白紙鋪于箱底，通道遠端放一鼠籠。將大鼠雙后肢蘸取碳素墨水，置于行走箱入口，大鼠在爬行過程中，每側(cè)后肢各留下4～5個足印，選擇印跡清晰足印，分別測量正常足(normal,N)及傷側(cè)足(experiment,E)的3個指標：(1)足印長度(print length，PL)，足尖到足跟的最大距離；(2)足趾寬度(toe spread,TS)，第1趾到第5趾的距離；(3)中間足趾寬度(intermediary toe spread,IT)，第2趾到第4趾的距離，結(jié)果精確到0.10 mm。將上述數(shù)據(jù)代入Bain公式，測得SFI(SFI=0為正常，SFI=-100為完全損傷)。SFI計算公式如下：SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT-8.8]

1.2.3血清制備及指標測量 股總動脈取血，離心(3 000 r/min，10 min) 取血清，分裝，置-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。ELISA檢測IL-1、IL-6、TNF-α水平，均嚴格按說明書操作。

1.2.4大鼠坐骨神經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察 股總動脈取血后解剖大鼠，取無損傷縫線標記處遠側(cè)端坐骨神經(jīng)(約0.60 cm)，4%甲醛溶液固定備用。常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察，拍照記錄。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠坐骨神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)比較 A組：術(shù)后第7天神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)基本正常，大部分軸索大小形態(tài)正常排列規(guī)則，個別輕度腫脹；大部分髓鞘結(jié)構(gòu)清楚，個別輕度變性；施萬細胞形態(tài)數(shù)量分布正常；神經(jīng)束膜個別炎細胞浸潤。第14、28天神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)基本正常，軸索大小形態(tài)正常排列規(guī)則，髓鞘結(jié)構(gòu)清楚，施萬細胞形態(tài)數(shù)量分布正常。B組：術(shù)后第7天神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，中度軸索腫脹，輕度髓鞘變性，施萬細胞中度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細胞浸潤。第14、28天神經(jīng)纖維重度排列紊亂，重度軸索腫脹及脫失，重度髓鞘變性及脫失，施萬細胞重度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細胞浸潤；且在第28天時有中度纖維組織增生。C、D組：術(shù)后第7天時神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，輕度軸索腫脹，輕度髓鞘變性，施萬細胞輕度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細胞浸潤。第14天時C、D組大鼠神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，C組大鼠中度軸索腫脹、中度髓鞘變性、施萬細胞中度減少，D組大鼠輕度軸索腫脹、輕度髓鞘變性、施萬細胞輕度減少，兩組神經(jīng)束膜均為輕度炎癥細胞浸潤。C組第28天時神經(jīng)纖維輕度排列紊亂，輕度軸索腫脹及脫失，輕度髓鞘變性及脫失，施萬細胞輕度減少，神經(jīng)束膜輕度炎癥細胞浸潤，輕度纖維組織增生；D組第28天神經(jīng)纖維組織結(jié)構(gòu)基本正常，大部分軸索大小形態(tài)正常排列規(guī)則，個別輕度腫脹；大部分髓鞘結(jié)構(gòu)清楚，個別輕度變性；施萬細胞形態(tài)數(shù)量分布正常；神經(jīng)束膜個別炎癥細胞浸潤，見圖1。

圖1各組大鼠術(shù)后各時間點坐骨神經(jīng)的病理組織學(xué)檢查(HE，×200)

2.2各組大鼠術(shù)后各時間點SFI比較 與A組比較，B組各時間點SFI明顯降低(P<0.01)，證實模型復(fù)制成功。C、D組SFI與同時間點B組比較升高，但術(shù)后7 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；C組術(shù)后28 d明顯升高(P<0.01)，D組術(shù)后14、28 d出現(xiàn)明顯增高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠SFI比較

a：P<0.01，與A組比較；b：P<0.01，與B組比較

2.3各組大鼠術(shù)后各時間點血清IL-1水平比較 與A組比較，B組術(shù)后7、14、28 d血清IL-1水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組血清IL-1水平明顯降低(P<0.05)，C組血清IL-1水平有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.4各組大鼠術(shù)后各時間點血清IL-6水平比較 與A組比較，B組術(shù)后7、14、28 d血清IL-6水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組大鼠血清IL-6水平明顯降低(P<0.05)，C組大鼠IL-6有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

2.5各組大鼠術(shù)后各時間點血清TNF-α水平比較 與A組比較，B組術(shù)后7、14、28 d血清TNF-α水平明顯升高(P<0.01)；與B組比較，D組大鼠術(shù)后7、14、28 d血清TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，C組除術(shù)后28 d血清TNF-α水平降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)外，術(shù)后7、14 d的血清TNF-α水平雖有所降低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表4。

表2 各組大鼠術(shù)后各時間點血清IL-1水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

表3 各組大鼠術(shù)后各時間點血清IL-6水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

表4 各組大鼠術(shù)后各時間點血清TNF-α水平比較

a:P<0.01,與A組比較;b:P<0.05,c:P<0.01,與B組比較

3 討 論

SFI是對神經(jīng)功能進行量化評價的客觀指標[8]。神經(jīng)損傷對SFI的影響繼發(fā)于踝關(guān)節(jié)跖屈，腳趾屈肌和足內(nèi)在因素的損傷，足跡的特征表現(xiàn)為大鼠印跡長度增加，腳趾展開的減少以及中腳趾展開減少[9]。對SFI的分析已被證明是評估SNI和修復(fù)后功能的可靠、可重復(fù)、經(jīng)濟且能定量的方法，通過對SFI的測量，可以直接反映SNI后的運動神經(jīng)功能[10]。本研究結(jié)果顯示，B組較A組SFI明顯降低(P<0.01)，證實了SNI模型建立成功，在本實驗劑量下，使用黑骨藤乙醇提取物治療SNI模型大鼠，可使大鼠的SFI明顯增加，且對SFI的提高呈劑量及時間依賴性，說明本實驗劑量的黑骨藤乙醇提取物治療，可以改善SNI模型大鼠的坐骨神經(jīng)功能，對SNI模型大鼠神經(jīng)的功能修復(fù)有明顯的治療作用。

周圍神經(jīng)纖維斷裂后，會出現(xiàn)一系列復(fù)雜的病理變化，如斷端遠側(cè)的軸突，很快發(fā)生華勒氏變性而崩解，近側(cè)端發(fā)生逆行性退變[11]，是神經(jīng)功能受損的病理基礎(chǔ)。在本實驗中，坐骨神經(jīng)HE染色證實，在本實驗時程內(nèi)黑骨藤乙醇提取物的治療，能夠明顯減輕神經(jīng)纖維的腫脹、減少神經(jīng)組織炎癥細胞的浸潤等，幫助神經(jīng)組織恢復(fù)正常的組織形態(tài)，且D組較C組效果明顯，術(shù)后28 d較術(shù)后7、14 d效果明顯，說明本實驗劑量和時程內(nèi)，黑骨藤乙醇提取物的治療可以改善受損坐骨神經(jīng)的形態(tài)學(xué)損傷，減輕炎性反應(yīng)程度，是本實驗中SNI模型大鼠神經(jīng)功能改善的病理學(xué)基礎(chǔ)。

WNT蛋白家族在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，對神經(jīng)軸突再生等起重要調(diào)節(jié)作用的，在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機制中扮演重要角色。激活WNT信號通路能夠刺激促炎因子TNF-α和IL-1的產(chǎn)生，加重神經(jīng)病理性疼痛的進展[12]。PNJ后，傷害性刺激從外周傳入中樞，膠質(zhì)細胞上相關(guān)分子模式感知這些信息后，會引起膠質(zhì)細胞激活，并使炎癥細胞浸潤釋放促炎性細胞因子，如IL-1、IL-6、TNF-α等，導(dǎo)致坐骨神經(jīng)發(fā)生炎性反應(yīng)[13-14]，神經(jīng)炎性反應(yīng)使傳遞痛覺的神經(jīng)元興奮，促進中樞敏化形成，在行為上則表現(xiàn)為痛覺等現(xiàn)象[15]。神經(jīng)炎性反應(yīng)在神經(jīng)病理性疼痛的形成中起著關(guān)鍵作用，減輕神經(jīng)炎性可以減輕疼痛保護改善神經(jīng)損傷[12]。本實驗結(jié)果顯示，與B組比較，C組在術(shù)后28 d TNF-α水平明顯降低，D組術(shù)后7 d IL-1、IL-6、TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。證實了黑骨藤乙醇提取物的治療可減輕SNI模型大鼠神經(jīng)炎癥從而減輕神經(jīng)疼痛，改善損傷的神經(jīng)功能。

傳統(tǒng)醫(yī)藥中，黑骨藤主要用于跌打損傷、風(fēng)濕等痛證。本研究以近年來免疫炎癥理論在PNJ中的應(yīng)用為前提，結(jié)合課題組前期研究工作，建立坐骨神經(jīng)鉗夾傷模型，證實黑骨藤對SNI有一定保護作用，并且其藥效與劑量、時間有關(guān)，其作用機制可能與抑制免疫炎癥因子分泌有關(guān)。