李 燕，李貴妃

(1.成都市婦女兒童中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，成都 610031；2.湖南師范大學醫(yī)學院，長沙 410006)

卵巢癌是發(fā)病率位居第三而死亡率最高的婦科腫瘤，由于其早期癥狀不明顯，早期診斷方法不成熟，因而早期即可發(fā)生廣泛轉移，發(fā)現(xiàn)時超過70%的患者已屬晚期，由于廣泛的腹腔轉移而無法手術根治[1]。腫瘤細胞的遷移、侵襲和對基質(zhì)的降解是卵巢癌發(fā)生轉移的三大步驟[2]。其中，在腫瘤細胞穿透基底膜并降解細胞外基質(zhì)的這個關鍵步驟中，多種蛋白酶發(fā)揮著至關重要的作用，尿激酶型纖溶酶原激活物(urokinase-type plasminogen activator,uPA)就是其中之一[3]。

烏司他丁(ulinastatin,UTI)作為尿激酶抑制劑，是一種從人類尿液中提取純化的糖蛋白，能有效抑制多種蛋白酶的活性，因而被廣泛應用于彌散性血管內(nèi)凝血、休克和胰腺炎等疾病的治療[4]。UTI還具有抗腫瘤的作用，已有研究證實其對乳腺癌、人口腔表皮樣癌、結腸癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制遷移和侵襲的能力，且其機制與UTI抑制腫瘤細胞中uPA的表達有關。目前國內(nèi)對于UTI在人卵巢癌治療方面的研究鮮有報道，為了研究證實UTI是否對人卵巢癌細胞的遷移和侵襲有抑制作用及其機制是否與uPA有關，本實驗探討了UTI對人卵巢癌細胞遷移和侵襲能力的影響，以及對 uPA表達水平的影響，為進一步研究UTI對人卵巢癌的臨床輔助治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞及主要試劑 人卵巢癌細胞系HO-8910PM購買于中科院上海細胞庫；胎牛血清和RPIM-1640購自杭州四季青生物工程材料有限公司；0.25%的胰酶購于美國GBICO公司；Matrigel購自美國BD公司；UTI購于廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司；AMV Reverse Transcriptase 購自美國Promega公司；DreamTaqTMGreen PCR Master Mix購自Fermentas公司；DNA MarkerⅠ購自日本TaKaRa公司；β-actin 單克隆抗體購自美國Sigma公司；HaltTMProtease Inhibitor Cocktail蛋白酶抑制劑、M-PER?Mammalian Protein Extraction Reagent和uPA抗體購自美國Thermo公司，HRP偶聯(lián)二抗購自美國Millipore公司；BCA Assay Reagent Kit、化學發(fā)光(ECL)試劑盒購自美國Pierce Chemical公司；其他常用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.2引物 引物用Primer Premier 5.0軟件設計并經(jīng)BLAST比對以后委托北京華大公司合成。uPA上游引物：5′-ACT CCA AAG GCAGCA ATG AA-3′，下游引物為：5′- AGA GTC TTT TGG CCA CAC TG-3′，產(chǎn)物長度469 bp。GAPDH上游引物為：5′- TAT AAA TTG AGC CCG CAG CC-3′，下游引物為：5′- ACA TGT AAA CCA TGT AGT TGA GGT-3′，產(chǎn)物長度244 bp。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HO-8910PM細胞接種于含10%胎牛血清的RPIM-1640細胞培養(yǎng)液中，37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天換液。 實驗所用的細胞均為處于對數(shù)生長期的細胞。

1.2.2實驗分組及給藥 將處于對數(shù)生長期的HO-8910PM細胞分為對照組和UTI 低、中、高劑量組，對照組加入100 μL磷酸鹽緩沖液(PBS)，UTI 低、中、高劑量組分別加入終濃度為400、800、1 600 U/mL UTI進行處理，處理后培養(yǎng)48 h再進行后續(xù)實驗。

1.2.3劃痕實驗 細胞按照前述分組及各組處理方式處理48 h后經(jīng)0.25%胰酶消化，制成5×105個/mL的細胞懸液，向6孔板每孔中加入2 mL細胞后放置于 37 ℃含5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中過夜，次日取出后用200 μL的黃色槍頭于6孔板中劃痕，用無血清的RPIM-1640培養(yǎng)液沖洗后，于顯微鏡下觀察并拍照。培養(yǎng)48 h后，再次于顯微鏡下觀察并拍照，用Image J 軟件來測量劃痕區(qū)域的細胞遷移距離。

1.2.4Transwell侵襲實驗 Matrigel先用冰預冷的RPIM-1640培養(yǎng)基稀釋成為2.5 mg/mL，按每孔25 μL加入24孔板的Transwell小室上腔，置于4 ℃冰箱過夜，使Matrigel聚合成膠。次日取對數(shù)生長期的對照組及各處理組細胞，經(jīng)0.25%胰酶消化后，離心并用RPIM-1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至2×106個/mL。上室接種100 μL不含血清的細胞懸液，下室加入500 μL含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基起趨化作用。每組設3個復孔，放置37 ℃恒溫、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h后，棄上室液體，擦凈膜上未侵襲的細胞及Matrigel，經(jīng)4%甲醛固定并用含 2%結晶紫的 2%乙醇染色，200倍光學顯微鏡下選擇濾膜上下左右中5個不同視野，計數(shù)每個視野侵襲細胞數(shù)。

1.2.5反轉錄PCR(RT-PCR)檢測細胞中uPA mRNA的表達 HO-8910PM細胞按照前述分組及各組處理方式加藥處理48 h后，按照TrizolTMReagent說明書進行總RNA抽提，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠)100 V電泳15 min后凝膠成像系統(tǒng)檢測RNA質(zhì)量，紫外分光光度計測定RNA濃度和純度。根據(jù)Promega公司反轉錄試劑盒說明書反轉錄合成cDNA，PCR反應體系為 20 μL，包括2×DreamTaqTMGreen PCR Master Mix 10 μL，cDNA 1.0 μL，上游引物(10 μmol/L)0.5 μL，下游引物(10 μmol/L)0.5 μL，添加去離子水使總體積達到20 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，32個循環(huán)；72 ℃最終延伸10 min。GAPDH作為內(nèi)參。取適量PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，Image J 軟件分析并計算目的基因uPA/GAPDH的灰度比值。

1.2.6Western blot檢測細胞uPA的表達 HO-8910PM細胞按照前述分組及各組處理方式加藥處理48 h后，迅速吸去培養(yǎng)液，并用冰預冷的PBS洗4次，每孔加入100 μL已加入HaltTMProtease Inhibitor Cocktail蛋白酶抑制劑的M-PER?Mammalian Protein Extraction Reagent，冰上放置30 min，間隔搖晃幾次；用乙醇處理過的細胞刮子將裂解的細胞刮下來，轉移至1.5 mL離心管。冰上超聲裂解細胞60 s，冰上放置15 min；1 300 r/min、4 ℃離心30 min，吸取上清至另一潔凈離心管中，分裝后保存于-80 ℃。提取的蛋白采用Pierce公司的BCA Protein Assay Reagent Kit進行定量。蛋白變性后取40 μg于12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上先80 V電泳1 h，再120 V電泳4 h，電泳結束后，用濕轉法將蛋白質(zhì)轉移到以聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；取下PVDF膜用麗春紅S染色，觀察轉膜效率。用含5%脫脂牛奶的-三乙醇胺緩沖鹽水(TBST)室溫封閉2 h；加入稀釋的一抗，4 ℃冷室中輕搖過夜，次日TBST洗3次，每次10 min；加入TBST稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次10 min；增強型ECL試劑盒進行ECL檢測，X光片壓片、顯影、定影。

A：顯微鏡下各組HO-8910PM細胞轉移能力(×100)；B：4組細胞遷移能力柱形圖a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖1各組HO-8910PM細胞轉移能力比較

A：顯微鏡下各組HO-8910PM細胞侵襲能力(×200)；B：4組細胞侵襲能力柱形圖；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖2各組HO-8910PM細胞侵襲能力比較

2 結 果

2.1UTI對人卵巢癌細胞HO-8910PM轉移能力的影響 劃痕實驗結果顯示：與對照組相比，隨著UTI濃度增加，細胞遷移能力呈明顯減弱趨勢，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2UTI對人卵巢癌細胞HO-8910PM侵襲能力的影響 HO-8910PM細胞經(jīng)不同濃度UTI處理后行Transwell實驗，結果顯示：細胞經(jīng)UTI處理后，穿過人工基底膜的細胞數(shù)明顯減少，侵襲能力受到明顯抑制，且呈濃度依賴，各組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3UTI對uPA mRNA表達水平的影響 RT-PCR結果顯示：隨著UTI濃度的升高，uPA mRNA的相對表達水平逐漸降低，各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

2.4UTI對uPA蛋白表達水平的影響 各處理組細胞uPA的蛋白表達水平較對照組明顯降低，隨著UTI濃度的升高，表達水平逐漸降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

1：對照組；2：低劑量組；3：中劑量組；4：高劑量組；A：PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳條帶；B：各組細胞uPA灰度值與GAPDH灰度值的比值柱形圖；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖3各組HO-8910PM細胞uPA mRNA表達水平比較

1：對照組；2：低劑量組；3：中劑量組；4：高劑量組；A：Western blot蛋白條帶；B：各組細胞uPA灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；a：P<0.05，與對照組比較；b：P<0.05，與低劑量組比較；c：P<0.05，與中劑量組比較

圖4各組HO-8910PM細胞uPA蛋白表達水平比較

3 討 論

卵巢癌之所以是死亡率最高的婦科腫瘤，其最主要的原因就是其轉移和復發(fā)率高。目前，傳統(tǒng)的根治性手術聯(lián)合輔助性化療仍是臨床上治療卵巢癌的基本方法[5]。但由于高轉移率及化療的毒副反應，患者的生存率并沒有提高。因此，探索卵巢癌侵襲轉移的機制，從而有效地控制卵巢癌細胞轉移，找到一種既能抑制卵巢癌細胞轉移，又安全有效的藥物，對改善卵巢癌患者的預后，提高其生存率具有重要的臨床意義[6]。

近年來，uPA系統(tǒng)在腫瘤轉移中的作用成為科學家們研究的熱點，已有大量實驗證實在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、肺癌、口腔癌、結腸癌和前列腺癌等惡性腫瘤及其轉移瘤中uPA的表達水平均比正常組織和良性腫瘤細胞要高[7]。uPA在卵巢癌的轉移中也發(fā)揮著至關重要的作用，鄒存華等[8]對卵巢癌HO-8910PM細胞的研究結果顯示uPA所激活的纖溶系統(tǒng)在卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。ZHANG等[9]的研究結果發(fā)現(xiàn)，卵巢癌中uPA的陽性率和血清學濃度均明顯高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，uPA的表達和卵巢癌的病理分期和遠處轉移具有相關性。KONECNY等[10]對卵巢癌的研究表明，uPA的表達水平可以作為判斷卵巢癌預后的獨立因子，uPA低表達患者的腫瘤無進展生存期和5年生存率高于高表達患者。本研究中檢測到HO-8910PM細胞侵襲能力與細胞中uPA mRNA表達水平和uPA蛋白表達水平呈正相關，通過抑制細胞中uPA mRNA和uPA蛋白表達水平可以明顯抑制細胞的侵襲轉移能力，這進一步證實uPA在卵巢癌的侵襲轉移中發(fā)揮著重要作用。

在深入探討uPA對卵巢癌侵襲轉移作用的同時，課題組也在思考能否通過抑制uPA表達從而達到抑制卵巢癌轉移的目的。本實驗中用到的UTI就是一種新型的uPA抑制劑。UTI一種從人類尿液中分離純化的尿胰蛋白酶抑制劑，能有效地抑制多種蛋白酶的活化，已被廣泛應用于彌散性血管內(nèi)凝血、休克和和胰腺炎等炎癥性疾病的治療。UTI還具有抗腫瘤的作用，已有研究證實其對乳腺癌、人口腔表皮樣癌、結腸癌等多種腫瘤細胞具有明顯的抑制遷移和侵襲的能力。目前國內(nèi)外多個課題組認為其機制與UTI抑制腫瘤細胞中uPA的表達有關。楊超文等[11]對體外肝癌細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，當UTI的濃度達到600 U/mL時，肝癌細胞SK-HEP-1細胞中uPA的mRNA和蛋白表達均減少，且隨UTI濃度增加到900 U/mL時，uPA可能即是UTI作用的直接靶點或其下游靶點，從而發(fā)揮抑制肝癌細胞遷移和轉移的作用。本文作者曾對高轉移性絨毛膜癌細胞體外研究也顯示uPA的表達水平與絨毛膜癌細胞的體外侵襲轉移密切相關，且UTI 可以通過降低uPA的表達水平從而有效抑制絨毛膜癌細胞的轉移[12]。KOBAYASHI等[13]對卵巢癌的研究中發(fā)現(xiàn)UTI的N-末端是UTI與腫瘤細胞結合位點，其C-末端則是抑制腫瘤轉移的部位。然而，UTI抑制腫瘤細胞轉移和侵襲的機制及UTI作用的靶點卻仍不明確。鑒于國內(nèi)對于UTI在人卵巢癌治療方面的研究鮮有報道，本實驗以高轉移人卵巢癌細胞HO-8910PM為研究對象，以證實UTI是否對人卵巢癌細胞的侵襲轉移有抑制作用及其機制是否與uPA有關。

本實驗中，劃痕實驗結果顯示UTI能夠有效地抑制 HO-8910PM細胞的轉移，且與UTI的濃度相關；預鋪Matrigel的Transwell小室充分模擬了天然基底膜結構，侵襲實驗結果顯示UTI能明顯抑制HO-8910PM細胞的侵襲性，且抑制作用與UTI的濃度相關。為了進一步探討其轉移和侵襲的機制，本研究用RT-PCR和Western blot方法檢測了uPA的表達情況，隨著UTI濃度的逐漸增加，uPA的mRNA和蛋白表達水平均逐漸降低，呈劑量依賴性，說明UTI 抑制卵巢癌細胞侵襲轉移可能是通過抑制細胞中uPA的mRNA和蛋白表達來實現(xiàn)的。

由于UTI來源于人體，抗原性小，對機體毒副反應小，不同于常規(guī)化療藥物，有開發(fā)為安全有效的抗腫瘤藥物的潛力，UTI有望通過下調(diào)卵巢癌細胞uPA的表達抑制卵巢癌的轉移，減少常規(guī)化療藥物的用量，緩解化療的毒副反應，改善預后。SONG等[14]對肝癌細胞的研究已經(jīng)表明抗腫瘤藥物表柔比星聯(lián)合UTI應用可以明顯改善肝癌預后。而本研究應用UTI干預HO-8910PM細胞后，細胞中uPA的表達水平下降，且與UTI 劑量負相關，同時其遷移和侵襲能力也呈下降趨勢，由此推測其作用機制可能與UTI下調(diào)了與卵巢癌侵襲轉移密切相關的 uPA基因表達有關，為UTI用于卵巢癌輔助治療用藥提供了理論依據(jù)和可能性，但具體作用機制還需進一步研究。