張 誠，周 超

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院胃腸外科，上海 200127)

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，尤其是農(nóng)村發(fā)病率極高其病死率較高，特別是在發(fā)展中國家，我國胃癌死亡病例數(shù)占全世界約40%。雖然近年來隨著醫(yī)學(xué)影像技術(shù)手段發(fā)展，胃癌的治愈率有所提高，但是早期診斷率仍極低，不及20%，使得眾多患者一確診基本處于中晚期，預(yù)后極差[1]。因此進一步的探尋胃癌早期診斷標記物對于胃癌的治療及預(yù)后將具有重大意義。miRNA是一類長度為21～23 nt的在真核生物鐘高度保守的非編碼RNA小分子，能與靶基因的3′非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控靶基因表達，進而參與細胞的生命過程。miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，近年來引起了眾多學(xué)者的興趣，miRNA-200家族就是一種[2-4]。miRNA-200家族包括5個成員(miRNA-200a，miRNA-200b，miRNA-200c，miRNA-141，miRNA-429)，研究顯示此家族成員在不同的腫瘤組織，不同的亞細胞中表達趨勢不一致，在眾多腫瘤組織中高表達，而在少數(shù)的腫瘤組織或細胞中低表達[5]。不過目前已有研究報道證實miRNA-200家族成員在胃癌組織中低表達[6-7]，但在胃癌的發(fā)生、發(fā)展的具體作用機制尚不清楚，因此本研究以miRNA-200家族成員之一的miRNA-141為研究對象，探討miRNA-141在胃癌細胞增殖、侵襲中的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人胃癌細胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1購于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2主要試劑和儀器 胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；Trizol總RNA提取試劑盒、LipofectamineTM3000脂質(zhì)體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(第一鏈cDNA合成試劑盒)購于大連寶生生物技術(shù)有限公司；miRNA-141 mimics和miRNA-141 NC購于廣州銳博技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)流式雙染試劑盒購于碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購于美國Corning公司；兔抗人增殖細胞核抗原(PCNA)、c-myc、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化AKT(p-AKT)多克隆抗體購于美國Abcam公司。MK3酶標儀購自美國thermo公司；Stepone plus 熒光定量PCR購自美國ABI公司；FACSCalibur型流式細胞儀；AF6000型熒光顯微鏡購于德國萊卡公司；GelDoc XR System凝膠成像系統(tǒng)購于伯樂生命科學(xué)產(chǎn)品上海有限公司。

1.2方法

1.2.1實時熒光定量PCR(real-time PCR)檢測miRNA-141的表達 微量紫外分光光度計檢測RNA純度，當檢測出的RNA純度(OD260nm/OD280nm=1.8)良好時候，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，基于 SYBR Green I 熒光分析的反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)分析，最后根據(jù)2-△△Ct法分析miRNA-141水平。miRNA-141上游引物：5′-GGU AGA AAU GGU CUG UCA CAA U-3′，下游引物：5′-AAU GCC UAA CAU GCA GUC GAU G-3′，GAPDH上游引物：5′-AGC CAC ATC GCT CAG ACA-3′，下游引物：5′-TGG ACT CCA CGA CGT ACT-3′。

1.2.2miRNA-141 mimics和miRNA-141 NC的轉(zhuǎn)染 當胃癌細胞生長程度達到50%左右時候，將用Opti-MEM稀釋好的LipofectamineTM3000與 miRNA-141 mimics和miRNA-141 NC混勻，加入到細胞中，6 h將細胞培養(yǎng)板中的液體吸走棄掉，換成含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，利用RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測細胞活力 將胃癌細胞接種到96孔板，細胞貼壁后，按“1.2.2”轉(zhuǎn)染48 h后，加入MTT孵育4 h后，每個96孔板細胞中加入150 μL二甲基亞砜，并將96板置于微量振蕩器上使結(jié)晶物溶解，于酶標儀波長560 nm處測OD值。

1.2.4Annexin V-FITC/PI流式細胞法檢測細胞凋亡 將胃癌細胞接種到6孔板，細胞貼壁后，按“1.2.2”轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，并按照Annexin V-FITC/PI流式細胞說明書操作按順序加入結(jié)合緩沖液、Annexin V-FITC及PI染液，最后在流式細胞儀上進行細胞凋亡分析。

1.2.5Transwell法檢測細胞侵襲能力 Transwell小室平鋪Matrigel膠，Transwell下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。將按“1.2.2”轉(zhuǎn)染48 h后的胃癌細胞制成單細胞懸液接種到Transwell上室，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，將小室取出來，用棉簽擦去Transwell上室細胞，用多聚甲醛固定Transwell下室細胞，結(jié)晶紫染色，在倒置顯微鏡下觀察細胞侵襲情況并計數(shù)。

1.2.6Western blot檢測細胞中MMP-2、MMP-9表達 將胃癌細胞接種到6孔板，細胞貼壁后，按“1.2.2”轉(zhuǎn)染48 h后，在4 ℃條件下收集、裂解細胞，并得到細胞中的總蛋白。BCA試劑盒測定總蛋白濃度，取30 g樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜30～50 min。2%的BSA室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔抗人PCNA、c-myc、MMP-2、MMP-9、PI3K、AKT、p-AKT多克隆抗體)4 ℃過夜孵育，第二天在室溫下孵育二抗，最后根據(jù)化學(xué)發(fā)光免疫試劑盒說明書在凝膠成像系統(tǒng)中曝光各蛋白條帶，并分析條帶灰度值。

2 結(jié) 果

2.1各組細胞株中miRNA-141表達水平比較 miRNA-141在胃癌細胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823中的表達水平(2.05±0.20、1.76±0.17、1.04±0.10、1.23±0.12、0.89±0.09、0.45±0.04)明顯低于正常人胃黏膜上皮細胞GES-1(2.87±0.30)表達水平(P<0.01)，其中在BGC-823表達水平最低，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

2.2miRNA-141 mimics組和miRNA-141 NC組miRNA-141表達水平比較 miRNA-141 mimics組、miRNA-141 NC組miRNA-141相對表達水平分別為2.38±0.21、0.39±0.04，miRNA-141 mimics組中miRNA-141表達水平較miRNA-141 NC組明顯上調(diào) (P<0.01)。

a：P<0.01，與GES-1比較

圖1 miRNA-141在各組細胞中的表達水平比較

2.3miRNA-141 mimics對BGC-823細胞活力及凋亡情況的影響 miRNA-141 mimics組細胞活力較miRNA-141 NC組明顯降低(P<0.01)。miRNA-141 mimics組細胞早期與晚期凋亡率較miR-141 NC組(0.68±0.07)明顯提高(P<0.01)，見表1。

2.4miRNA-141 mimics對BGC-823細胞侵襲能力的影響 miRNA-141 mimics組、miRNA-141 NC組細胞侵襲數(shù)目分別為(43.79±4.38)、(178.44±17.50)個，miRNA-141 mimics組細胞侵襲數(shù)目較miRNA-141 NC組明顯降低(P<0.01)，見圖2。

表1 miRNA-141 mimics對BGC-823細胞活力及凋亡的影響

a：P<0.01，與miRNA-141 NC組比較

A：miRNA-141 NC組；B：miRNA-141 mimics組

圖2倒置顯微鏡下兩組BGC-823細胞侵襲能力顯像(×200)

2.5兩組BGC-823細胞中PCNA、c-myc等表達水平比較 miRNA-141 mimics組中PCNA、c-myc、MMP-2、MMP-9、PI3K、p-AKT表達水平較miRNA-141 NC組明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.01)，見圖3。

A：miRNA-141 NC組；B：miRNA-141 mimics組；a：P<0.01，與miRNA-141 NC組比較

圖3兩組BGC-823細胞中PCNA、c-myc等表達水平比較

3 討 論

miRNA-200家族是近年的熱點研究miRNA，此家族包括5個成員，分為兩個亞族，不同亞族之間既具有相同的功能，也具有特殊性。其中miRNA-141位于人12號染色體，在肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌及胰腺癌等腫瘤中表達失調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。同時GOMES等[9]通過采用自組織映射圖(self-organizing maps)鑒定出胃癌組織中的miRNA表達譜，miRNA-141就是其中一種失調(diào)的miRNA。后來LU等[10]研究證實miRNA-141在胃癌組織中低表達，并與腫瘤分化、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移正相關(guān)。ZHANG等[11]研究利用miRNA微陣列證實包括miRNA-141在內(nèi)的5個miRNA在胃癌血漿中低表達。而且ZHOU等[12]研究證實miRNA-141不僅在胃癌組織中低表達，當miRNA-141過表達后能夠與MEG3相互作用或者靶向調(diào)控E2F3表達進而參與胃癌的發(fā)生。充分說明miRNA-141與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但是miRNA-141對胃癌細胞的增殖及侵襲的影響還少見報道，所以本研究將對此展開探討。本研究首先利用RT-PCR法檢測胃癌細胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823及正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1中miRNA-141表達，結(jié)果表明胃癌細胞中的miRNA-141表達低于GES-1細胞，與miRNA-141在胃癌組織及癌旁組織中的表達趨勢一致[9-12]。接著利用脂質(zhì)體將miRNA-141 mimics及miRNA-141 NC轉(zhuǎn)染到BGC-823細胞中，RT-PCR法證實轉(zhuǎn)染成功。而且MTT法及Annexin V-FITC/PI流式雙染結(jié)果表明miRNA-141 mimics能明顯地降低BGC-823細胞活力，提高細胞早期及晚期凋亡率，與miRNA-141在其他腫瘤細胞中的作用效果一致[13-14]。另外本研究還利用Transwell法檢測miRNA-141 mimics對BGC-823細胞侵襲能力的影響，結(jié)果表明miRNA-141 mimics能明顯地抑制細胞的侵襲能力。從而說明miRNA-141 mimics能明顯抑制BGC-823細胞活力及侵襲能力，同時誘導(dǎo)細胞凋亡。

腫瘤細胞的無限增殖受多種蛋白的調(diào)控，PCNA就是其中一種。PCNA是從系統(tǒng)性紅斑狼瘡中發(fā)現(xiàn)的與DNA的復(fù)制密切相關(guān)的一種核蛋白質(zhì)，能推動細胞的增殖。另外癌基因及抑癌基因在細胞的增殖與凋亡中亦起著重要的調(diào)控作用。C-myc被認為是癌基因，能促進細胞分裂，使細胞獲得無限增殖的可能。MMPs蛋白水解酶所介導(dǎo)的細胞外基質(zhì)的降解是腫瘤細胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移的必經(jīng)過程之一。MMP-2不僅能夠通過降解細胞外基質(zhì)成分促進癌細胞擴散，還能夠通過誘導(dǎo)血管新生進一步的促進腫瘤細胞擴散浸潤。MMP-9是分子量最大的MMP，能夠降解包括Ⅳ在內(nèi)的幾乎所有的細胞外基質(zhì)成分。因此本研究繼續(xù)利用Western blot檢測miRNA-141 mimics對BGC-823細胞中PCNA、c-myc、MMP-2及MMP-9表達的影響，結(jié)果表明miRNA-141 mimics能明顯下調(diào)PCNA、c-myc、MMP-2及MMP-9表達，繼而抑制細胞的增殖與侵襲。

PI3K/AKT信號通路又被稱為抗凋亡信號通路，在眾多腫瘤組織中被高度激活。當PI3K受到上游信號刺激后，能使磷脂酰二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的3′羥基磷酸化，轉(zhuǎn)化為三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)，進而使AKT結(jié)構(gòu)發(fā)生變化并在絲氨酸/蘇氨酸位點磷酸化，p-AKT進一步的調(diào)控下游靶蛋白(Bcl-2、MMPs)的表達，參與細胞的增殖、凋亡、侵襲等生物學(xué)行為。而且有研究證實PI3K/AKT信號通路拮抗劑PH域富含亮氨酸重復(fù)蛋白磷酸酶(PHLPP)1及PHLPP2 能扭轉(zhuǎn)miRNA-141在非小細胞肺癌細胞中的作用[15]，提示miRNA-141與PI3K/AKT信號通路之間具有明顯相關(guān)性。所以本研究繼續(xù)利用Western blot檢測miRNA-141 mimics對BGC-823細胞中PI3K/AKT信號中相關(guān)蛋白表達的影響，結(jié)果表明miRNA-141 mimics能明顯的下調(diào)PI3K及p-AKT表達。

綜上所述，miRNA-141在胃癌細胞NCI-N87、SGC-7901、MGC-803、MKN-45、HGC-27、BGC-823中的表達水平低于正常人胃黏膜上皮細胞株GES-1中表達水平，提高BGC-823細胞中miRNA-141表達水平，能明顯降低細胞活力，提高細胞凋亡率，抑制細胞侵襲，并下調(diào)PCNA、c-myc、MMP-2及MMP-9表達，可能與抑制PI3K/AKT信號通路有關(guān)。