王譯文，李 民，阿布都艾合提·買買提明，程方雄，羅少鋒，何 峰，王必蓉

(1.武漢市第四醫(yī)院/華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢普愛醫(yī)院檢驗科，武漢 430077；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院肝膽外科，武漢 430022；3.武漢市第四醫(yī)院/華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢普愛醫(yī)院甲乳外科，武漢 430077)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)致死率排名第2位的惡性腫瘤，每年大約有782 500例新發(fā)病例[1-2]。雖然手術(shù)、肝移植和射頻消融等治療手段可以延長患者的生存期，但其高復(fù)發(fā)率及遠處轉(zhuǎn)移最終導(dǎo)致患者預(yù)后不良[3]。因此，研究HCC的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移、侵襲的分子機制，對提高HCC的治療水平具有重要意義。Ⅳ型膠原蛋白基因α1(collagen type Ⅳ alpha 1，COL4A1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，其編碼的血清Ⅳ型膠原α1鏈是基底膜的重要組成成分[4]。已有研究證實COL4A1在胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、頭頸部鱗狀細胞癌及甲狀腺乳頭狀癌中明顯高表達，并與腫瘤細胞的增殖、分化和遷移密切相關(guān)[5-6]。然而，COL4A1在HCC中的表達及其功能國內(nèi)外鮮有報道。本研究旨在闡明COL4A1在人HCC中的表達情況，并探討其在HCC發(fā)生、發(fā)展中的作用，為HCC的診斷與治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2008年1月至2015年12月武漢市第四醫(yī)院/華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢普愛醫(yī)院手術(shù)切除的68例HCC組織標本，切取肝癌組織及其配對的癌旁組織(距離腫瘤邊緣5 cm以上)，所有病例均經(jīng)組織病理學(xué)診斷確認，所有患者術(shù)前均未接受放化療及靶向治療。新鮮離體標本均置于液氮中保存。本實驗經(jīng)該院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。在68例肝癌患者中，男51例，女17例，患者中位年齡為51歲；28例腫瘤直徑大于或等于5 cm；Ⅰ+Ⅱ期53例，Ⅲ+Ⅳ期 15例。

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué) 訪問GEO數(shù)據(jù)集，下載HCC GSE14520數(shù)據(jù)，分析COL4A1 mRNA在HCC及癌旁組織表達差異性。

1.2.2COL4A1蛋白表達檢測 取出組織并按80 mg/mL濃度加入裂解液裂解細胞，提取總蛋白。取得上清液采用BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Pierce公司)測定蛋白水平。采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，使用等體積的上樣緩沖液加樣，經(jīng)過電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜；室溫封閉2 h，孵育稀釋的一抗COL4A1(美國Santa Cruz公司)和β-actin(美國Thermo公司)，室溫1 h后4 ℃過夜。洗膜后孵育稀釋的二抗，室溫2 h；洗膜后曝光檢測。

1.2.3細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)人HCC細胞系HepG2，培養(yǎng)基選用DMEM(美國Gibco公司)，內(nèi)含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素。將對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜待細胞貼壁即可轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 2000(美國invitrogen公司)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書上的步驟進行操作，轉(zhuǎn)染后使用反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)評估轉(zhuǎn)染效果。

1.2.4細胞增殖試驗 使用胰酶消化、重懸、調(diào)整細胞密度后加入96孔板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；每孔加入CCK-8溶液(日本Dojindo公司)10 μL后，繼續(xù)孵育1 h；將96孔板放入酶標儀中，在450 nm波長處讀取吸光度值。檢測細胞在第1～4天時的吸光度值，并繪制生長曲線。

1.2.5細胞遷移和侵襲試驗 遷移試驗步驟為：使用對數(shù)生長期的HepG2細胞，用胰酶消化、重懸、調(diào)整細胞密度后，加入Transwell小室，并加入無血清培養(yǎng)基100 μL；下室加入800 μL完全培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)48 h后，取出Transwell小室，丟棄培養(yǎng)液，并用無菌棉簽小心拭去上室底部的細胞，4%多聚甲醛固定細胞20 min，0.1%結(jié)晶紫染色15 min，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后將Trasnwell小室置于顯微鏡下觀察計數(shù)。侵襲試驗與遷移試驗基本相同，不同點為侵襲實驗使用濾膜附有Matrigel的Transwell小室。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué) 通過統(tǒng)計學(xué)分析GSE14520數(shù)據(jù)庫，結(jié)果顯示HCC組織COL4A1 mRNA表達水平明顯高于配對癌旁組織(P<0.01)，見圖1。

圖1 COL4A1 mRNA在HCC組織及癌旁組織表達水平

2.2COL4A1在HCC組織和癌旁組織中的表達 COL4A1在HCC組織中的表達水平為0.912±0.153，明顯高于癌旁組織的0.725±0.138，二者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 Western blot檢測COL4A1在HCC組織(T)及癌旁組織(N)中的表達

2.3COL4A1表達水平與臨床特征的關(guān)系 按COL4A1表達水平高低將患者排序，并分為高表達組和低表達組各34例，分析COL4A1表達與患者臨床特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，COL4A1的表達水平與腫瘤分期明顯相關(guān)，高COL4A1表達患者TNM分期高(P<0.05)，見表1。

表1 COL4A1表達與HCC患者臨床特征的關(guān)系 [n(%),n=34]

續(xù)表1 COL4A1表達與HCC患者臨床特征的關(guān)系 [n(%),n=34]

2.4敲低COL4A1后對HCC細胞增殖能力的影響 敲低COL4A1可明顯抑制HepG2細胞的增殖能力，且抑制作用隨著作用時間的延長而增加(P<0.01)，見圖3。

圖3 CCK-8試驗檢測敲低COL4A1對HepG2細胞增殖的影響

2.5敲低COL4A1后對HCC細胞遷移能力的影響 敲低COL4A1可明顯降低HepG2細胞的遷移能力(P<0.01)，見圖4。

A：對照組(×200);B:COL4A1敲低組(×200)；C:遷移實驗統(tǒng)計圖;a:P<0.01,與對照組比較

圖4兩組HCC細胞遷移能力比較

2.6敲低COL4A1后對HCC細胞侵襲能力的影響 敲低COL4A1可明顯降低HepG2細胞的侵襲能力(P<0.05)，見圖5。

A:對照組(×200)；B:COL4A1敲低組(×200)；C:侵襲實驗統(tǒng)計圖;a:P<0.05,與對照組比較

圖5兩組HCC細胞侵襲能力比較

3 討 論

HCC是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高、進展迅速、預(yù)后差，嚴重地威脅著人類的健康。由于HCC起病隱匿，大多數(shù)患者就診時因早期浸潤生長并發(fā)遠處轉(zhuǎn)移而失去根治性手術(shù)機會，此外癌細胞的遷移和侵襲是HCC治療失敗和復(fù)發(fā)的重要原因。因此，研究HCC細胞的遷移和侵襲能力，對于后續(xù)探索HCC發(fā)生、發(fā)展的分子機制及降低HCC細胞轉(zhuǎn)移風(fēng)險具有重要意義。

COL4A1蛋白由氨基末端7S結(jié)構(gòu)域、三螺旋形成膠原結(jié)構(gòu)域和羧基末端非膠原結(jié)構(gòu)域共同組成，并與其他細胞外基質(zhì)成分，如基底膜蛋白多糖、蛋白聚糖及層連蛋白相互作用[7]。COL4A1的羧基末端非膠原結(jié)構(gòu)域經(jīng)過溶蛋白性裂解生成具有生物活性片段，在血管生成和腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其表達受趨化因子受體7(CXCR7)及其下游的磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、核因子-κB(NK-κB)調(diào)節(jié)[7-8]。此外，COL4A1基因的突變與腦出血、遺傳性血管病、腎病、動脈瘤及肌肉痙攣等密切相關(guān)[9]。MIYAKE等[10]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱尿路上皮癌細胞可通過產(chǎn)生COL4A1與COL13A1，激活細胞內(nèi)的AKT信號通路，使E-cadherin轉(zhuǎn)換為N-cadherin，從而增加癌細胞的侵襲能力。SALEM等[11]發(fā)現(xiàn)COL4A1在乳腺癌中亦高表達，且在體外試驗中過表達COL4A1可促進乳腺癌細胞增殖及遷移；敲低其表達可明顯降低癌細胞存活率并導(dǎo)致癌細胞細胞周期停滯。另有研究證實，在乳腺癌發(fā)生及發(fā)展中COL4A1的表達與P4HA2的表達密切相關(guān)；異常高表達的P4HA2可通過上調(diào)下游COL4A1的表達促進腫瘤細胞增殖及轉(zhuǎn)移[12]。此外，亦有研究報道COL4A1是頭頸部鱗狀細胞癌[13]、甲狀腺乳頭狀癌[14]潛在治療的靶基因。

近期研究證實，COL4A1亦在消化道惡性腫瘤中有重要意義。曲妥珠單抗是針對人表皮生長因子受體2(HER2)的靶向抗體，用于治療HER2過表達的胃癌患者。HUANG等[5]研究發(fā)現(xiàn),COL4A1在胃癌組織和曲妥珠單抗胃癌細胞中高表達，COL4A1可能賦予胃癌對曲妥珠單抗的耐藥性。此外，COL4A1被證實可作為肝內(nèi)膽管細胞癌的診斷標志物[15]。迄今尚未有關(guān)于COL4A1的表達與HCC發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的研究報道。本課題組通過分析HCC數(shù)據(jù)庫及檢測臨床配對HCC標本，首次發(fā)現(xiàn)COL4A1在HCC組織中明顯高表達，且其表達水平與TNM分期相關(guān)，高COL4A1表達患者TNM分期高。隨后本課題組通過細胞增殖、遷移及侵襲等體外實驗證實，敲低COL4A1表達可明顯降低HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲能力。據(jù)此，本課題推測COL4A1可能在HCC細胞的增殖、遷移及侵襲中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本課題組首次提出COL4A1可能是肝細胞癌的潛在癌基因，并可能通過影響腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。COL4A1可能作為HCC診斷和治療的新的生物靶點。本課題組擬后續(xù)深入探討COL4A1參與HCC發(fā)生、發(fā)展的具體信號通路，為COL4A1的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。