全 鋼，賈鎧寧，于 果，許堯祥，岳 金，肖文林△

(1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第四師醫(yī)院口腔頜面外科，新疆伊寧 835000； 2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科/青島大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院/青島大學(xué)附屬醫(yī)院山東省教育廳口腔重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266555)

盡管唇裂修復(fù)術(shù)手術(shù)縫線不斷更新、術(shù)式不斷改良，但是唇裂術(shù)后瘢痕甚至瘢痕的增生不僅影響患者面部的美觀，甚至對(duì)患者的心理造成不良影響?；蛑委熡糜诟纳苽谛迯?fù)方面是一個(gè)新的概念，其為從根本上防治瘢痕的增生性病變提供了可能。如果不針對(duì)特定的因子突變位點(diǎn)進(jìn)行基因敲除，可能引起皮膚正常發(fā)育紊亂甚至動(dòng)物死亡。因此，研究傷口愈合的理想模型是于局部傷口中應(yīng)用基因轉(zhuǎn)導(dǎo)使某種基因敲除或過表達(dá)，來觀察其對(duì)傷口修復(fù)機(jī)制的影響。鑒于以往的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可知，腺病毒是針對(duì)皮膚瘢痕進(jìn)行基因治療的理想載體。本實(shí)驗(yàn)的目的是構(gòu)建p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)基因沉默病毒載體，為唇裂術(shù)后瘢痕增生的基因治療提供理論支持。

表1 p38MAPK的shRNA序列

F:正向；R:反向

1 材料與方法

1.1材料 (1)動(dòng)物：新西蘭兔64只，購(gòu)自青島康大生物科技有限公司。(2)儀器與試劑：冷凍高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Thermo fisher公司，DNA電泳系統(tǒng)、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，M199液體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，T4 DNA Ligase、Pst Ⅰ、BamH Ⅰ購(gòu)自美國(guó)NEB公司，胎牛血清(Gibco)、HEK293A細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，DH5a感受態(tài)細(xì)胞、小量質(zhì)粒抽提試劑盒、Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker購(gòu)自北京全式金生物公司，DNA測(cè)序購(gòu)自上海生工生物公司，腺病毒干擾載體質(zhì)粒購(gòu)自北京歐林格生物公司， shRNA片段合成購(gòu)自南京金斯瑞生物公司，Qiagen大規(guī)模質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司，pDC316-ZsGreen-ShRNA腺病毒試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biovector公司。

1.2方法

1.2.1pDC316-ZsGreen-ShRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用p38MAPK序列cDNA文庫(kù)設(shè)計(jì)shRNA序列，經(jīng)Blast表明其與小鼠其它c(diǎn)DNA序列不同源，合成3條含干擾序列的雙鏈DNA oligo。根據(jù)p38MAPK序列設(shè)計(jì)shRNA，合成3個(gè)shRNA片段，合成序列見表1。DNA片段經(jīng)由退火緩沖液完全退火后，3對(duì)片段分別用T4連接酶將其與pDC316-shRNA-ZsGreen連接起來。將10 μL過夜連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100 μL感受態(tài)細(xì)胞，涂于含氨芐西林的LB培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。在5 mL，100 μg/mL Ampicillin抗性的LB培養(yǎng)液中分別挑取1個(gè)單菌落接種培養(yǎng)，250 r/min，37 ℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)過夜。隨后抽提質(zhì)粒，分別用BamHⅠ和EcoRⅠ做酶切鑒定。構(gòu)建的3組重組質(zhì)粒分別命名為pDC316-ZsGreen-ShRNA-1、2、3。

1.2.2AD-shRNA-p38MAPK腺病毒病毒包裝 將HEK293A細(xì)胞種在面積為10 cm2培養(yǎng)皿中，傳代培養(yǎng)。使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度后重新接種于6孔板中。用500 μL無血清稀釋培養(yǎng)基對(duì)4 μg pDC316-ZsGreen-ShRNA重組質(zhì)粒、10 μg Pshutter-CMV、10 μg pAdenoviral vector稀釋，充分混勻。加入30 μL Lipofectamine3000脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，室溫靜置20 min。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物逐滴加入HEK293A細(xì)胞培養(yǎng)皿中。第2天利用完全培養(yǎng)基對(duì)去除含DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物進(jìn)行培養(yǎng)，48～72 h可產(chǎn)生大量病毒。對(duì)病毒進(jìn)行收集，使用0.45 μm濾器進(jìn)行過濾4 ℃、10 000 r/min超速離心2 h后棄上清液，沉淀物為p38MAPK基因RNAi腺病毒載體將沉淀下的載體分裝后，保存于-80 ℃冰箱。將腺病毒載體分為3組，分別為AD-shRNA-p38MAPK-1、AD-shRNA-p38MAPK-2、AD-shRNA-p38MAPK-3。將純化的病毒倍比稀釋后轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞，48 h熒光顯微鏡觀察熒光；稀釋病毒上清液的體積均為107μL。將HEK293A細(xì)胞放于12孔培養(yǎng)板中，混勻后培養(yǎng)于37 ℃ CO2孵箱。24 h后添加100 μL完全培養(yǎng)基。4 d后觀察熒光表達(dá)情況。隨著稀釋倍數(shù)的增加，熒光細(xì)胞數(shù)減少。換算公式：滴度(TU/mL)=熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)/病毒原液量

1.2.3分離培養(yǎng)兔皮膚成纖維細(xì)胞 用水合氯醛將新西蘭兔麻醉后俯臥位固定，乙醇棉球消毒脫毛區(qū)后切取約2 cm×3 cm的皮膚。放于250 U/mL雙抗生理鹽水中浸泡滅菌30 min，而后刮去皮下脂肪等。用PBS洗滌數(shù)遍，剪成約1 mm3左右的皮片。常溫下用混合酶消化45 min，持續(xù)振蕩。細(xì)胞沉淀重懸后接種培養(yǎng)。棄培養(yǎng)基，先用PBS洗1遍，而后加入1～2 mL胰酶，消化。1 000 r/min離心3 min，棄上清液，加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)傳代。

1.2.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)腺病毒感染皮膚成纖維細(xì)胞后p38MAPK的干擾效率 調(diào)整細(xì)胞密度而后重新接種于6孔板中，培養(yǎng)過夜，細(xì)胞貼壁后感染。感染前2 h換液。按照每孔感染復(fù)數(shù)(MOI)=1∶5比例加入病毒。感染48 h后，參照說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)。每一標(biāo)本分別放入3個(gè)復(fù)孔中，得出每組的Ct值，從而計(jì)算出每組的相對(duì)表達(dá)水平。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。RT-PCR檢測(cè)的目的基因引物序列的正義鏈：5′-GGG ACC TAA AGC CTA GTA AC-3′；反義鏈：5′-CGA CCG ACC AAA TAT CAA-3′。內(nèi)參β-actin引物序列正義鏈：5′-TGG CTC TAA CAA GTC CGC CTA G-3′；反義鏈：5′-AGT GCG ACG TGG ACA TCC G-3′。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒的酶切鑒定及測(cè)序結(jié)果 將重組質(zhì)粒分別以BamHⅠ和EcoRⅠ做酶切鑒定，鑒定酶切圖譜見圖1。挑取酶切鑒定正確的陽性菌測(cè)序，測(cè)序峰圖見圖2。酶切鑒定結(jié)果及測(cè)序結(jié)果說明，3個(gè)pDC316-shRNA-ZsGreen質(zhì)粒均完全符合設(shè)計(jì)要求。

M：Marker;1、2、3：構(gòu)建的質(zhì)粒；4：空白對(duì)照組

圖1重組質(zhì)粒PCR酶切鑒定圖

2.2轉(zhuǎn)染后HEK293A的細(xì)胞效應(yīng) pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-1、pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-2、pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-3載體分別共轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后，HEK293A細(xì)胞變圓，部分融合，出現(xiàn)多核復(fù)合體，見圖3。

2.3兔皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng) 顯微鏡下，原代兔上唇皮膚成纖維細(xì)胞，大致呈梭形或紡錘形，見圖4。

2.4real-time PCR檢測(cè)腺病毒感染目的細(xì)胞后p38MAPK的干擾效率 校準(zhǔn)基因?yàn)楣芗一颚?actin作為空白對(duì)照組，兔上唇成纖維細(xì)胞p38MAPK mRNA的相對(duì)表達(dá)水平定為1；所有標(biāo)本重復(fù)3次，計(jì)算-△△ct，以平均相對(duì)表達(dá)水平為2-△△Ct計(jì)算其他各病毒轉(zhuǎn)染組兔上唇成纖維細(xì)胞p38MAPK 的 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。與空白對(duì)照組比較，各組p38MAPK mRNA相對(duì)表達(dá)水平均有不同降低，其中AD-shRNA-p38MAPK-1組的p38MAPK的mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖5。

1、2、3：重組質(zhì)粒pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK-1、2、3；4：重組質(zhì)粒NC組

圖2 p38MAPK干擾序列測(cè)序結(jié)果圖

圖3 pDC316-ZsGreen-shRNA-p38MAPK轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病理效應(yīng)(×200)

圖4 培養(yǎng)的兔上唇成纖維細(xì)胞(×400)

1:AD-shRNA-p38MAPK-1組；2:AD-shRNA-p38MAPK-2組；3:AD-shRNA-p38MAPK-3組；4:pDC316-ZsGreen-shRNA-scramble組；5:空白對(duì)照組；a:P<0.05，與AD-shRNA-p38MAPK比較

圖5 p38MAPK腺病毒轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞mRNA相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

傷口的愈合分為兩種：一種是由與受損傷部位特性相同的細(xì)胞修復(fù)即完全性修復(fù)，常見于表淺傷口的正常愈合及胎兒傷口無瘢痕愈合；另一種是幾乎所有傷口愈合的結(jié)局，即上皮化的同時(shí)瘢痕形成。傷口收縮是加速傷口愈合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但是過度的收縮則會(huì)導(dǎo)致傷口攣縮的發(fā)生，嚴(yán)重影響機(jī)體的功能和美觀。但目前尚未發(fā)現(xiàn)可以抑制瘢痕形成的方法。

MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。MAPKs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路存在于大多數(shù)細(xì)胞內(nèi)，p38MAPK是其一個(gè)亞家族，是MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路一種經(jīng)典途徑[1-2]。其參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分裂，并在傷口愈合中發(fā)揮作用。有研究表明，瘢痕成纖維細(xì)胞的分化依賴于α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)及機(jī)械力的參與[3]。陳偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)MKK3、MKK6和p38MAPK基因表達(dá)在早期妊娠胎兒的皮膚組織中表達(dá)較強(qiáng)。隨著胎齡的增加，其表達(dá)逐漸減弱，其基因表達(dá)的變化與傷口愈合形成瘢痕的過程相一致。從而發(fā)現(xiàn)MKK3、MKK6和p38MAPK基因高表達(dá)可能是早期妊娠胎兒皮膚傷口無瘢痕愈合的原因。杜啟翠等[5]的研究表明，p38MAPK阻斷劑可以減少成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，減少α-SMA和TGF-β1的表達(dá)，從而可以防止皮膚瘢痕的形成。這些研究均表明在傷口的愈合中p38MAPK信號(hào)通路可能起著舉足輕重的作用，同時(shí)其之間的關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究。

基因治療是指將外源正?；?qū)胧荏w細(xì)胞，以糾正或補(bǔ)償基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療疾病的目的，可基因治療最初被認(rèn)為只是一種治療先天性代謝功能缺陷或晚期惡性腫瘤患者的方式[6]?；蚩赏ㄟ^體內(nèi)或體外的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。載體的選擇對(duì)于基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)十分關(guān)鍵[7-9]。目前,基因治療中基因轉(zhuǎn)導(dǎo)方式有兩種，分別是病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)和非病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。病毒的基因轉(zhuǎn)染的效率明顯偏高。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的創(chuàng)傷基因治療的理想模型具有高效性、自限性、靶向性、少或無毒副作用及特異性。腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒為最常用的病毒載體。腺病毒是目前瞬時(shí)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)最有效的載體，因其廣泛的細(xì)胞趨向性，可以作為不同組織的良好指示劑。反轉(zhuǎn)錄病毒載體具有能夠整合入宿主細(xì)胞基因組的優(yōu)點(diǎn)，因此具有實(shí)現(xiàn)缺陷基因的終生校正的潛力。使用反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)導(dǎo)效率低，因?yàn)檩d體需要轉(zhuǎn)染分裂細(xì)胞，并且在體內(nèi)不穩(wěn)定[10]。研究已表明皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率高達(dá)95%，皮膚轉(zhuǎn)染模型安全性較高。因此，人類腺病毒是基因治療中最常見的病毒載體。STITELMAN等[11]的研究表明，腺病毒介導(dǎo)的血小板源性生長(zhǎng)因子β(PDGF-β)的基因轉(zhuǎn)移克服了傷口愈合中的缺血缺陷，并對(duì)于治療慢性非愈合性傷口提供了希望，其病毒的衣殼蛋白作用可能是腺病毒引起急性炎性反應(yīng)的原因。皮膚是腺病毒介導(dǎo)的基因治療的理想靶器官[12-13]。ARAGONA等[14]的研究表明,在小鼠皮膚上腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染基因可高效表達(dá)。免疫反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥是腺病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)中對(duì)傷口愈合最大的影響，而SYLVESTER等[15]的文獻(xiàn)表明，盡管腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的小鼠模型皮膚傷口出可能引發(fā)急性炎性反應(yīng),但并未最終影響受傷皮膚的愈合能力。

成纖維細(xì)胞是皮膚疏松結(jié)締組織中的重要細(xì)胞，也是瘢痕形成過程中的重要細(xì)胞。瘢痕是在傷口愈合過程中，肌成纖維細(xì)胞形成，從而使創(chuàng)口收縮而形成的?，F(xiàn)在已有成熟的成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，基因檢測(cè)技術(shù)更加成熟[16]。

本實(shí)驗(yàn)取新西蘭白兔上唇皮膚，成功培養(yǎng)出成纖維細(xì)胞，將構(gòu)建的病毒載體可以成功轉(zhuǎn)染到皮膚成纖維細(xì)胞中，并運(yùn)用此細(xì)胞篩選出沉默效率最高的一個(gè)腺病毒載體，為其能在活體局部注射后取得良好的沉默效果奠定了基礎(chǔ)。