張 勇，李蓓蕾，梁修朗，唐莫玲，黃梓健，范郁山

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，南寧 530001)

糖尿病性胃輕癱(diabetic gastro paresis，DGP)是以胃動(dòng)力障礙、胃排空延遲為主要特征的糖尿病常見(jiàn)慢性并發(fā)癥之一，超過(guò)50%的患者出現(xiàn)餐后飽脹感、反流、上腹不適、惡心、嘔吐、厭食等，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量[1-2]。DGP發(fā)病機(jī)制多認(rèn)為與胃腸激素紊亂、Cajal間質(zhì)細(xì)胞病變、自主神經(jīng)病變有關(guān)[3]。胃腸激素是調(diào)控胃腸運(yùn)動(dòng)的重要因素，近年來(lái)有關(guān)胃腸激素研究逐漸增多，有代表意義的是促生長(zhǎng)素(Ghrelin)和膽囊收縮素(CCK)[4]。腦腸肽是同時(shí)存在于胃腸道和大腦的胃腸激素或神經(jīng)肽，對(duì)胃腸道運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)和分泌功能具有調(diào)控作用。Ghrelin又稱(chēng)胃饑餓素，是一種促進(jìn)食欲的腦腸肽，是生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體，能夠促進(jìn)生長(zhǎng)激素(GH)分泌、增加食欲、促進(jìn)攝食及胃腸運(yùn)動(dòng)[5]。CCK是由十二指腸I細(xì)胞分泌的廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道的胃腸激素，作為經(jīng)典腦腸肽的一員，可以通過(guò)誘發(fā)中樞飽感信號(hào)、減少攝食行為和胃腸運(yùn)動(dòng)而抑制食欲[6-7]。目前臨床治療DGP常用促胃動(dòng)力藥物以緩解癥狀，但遠(yuǎn)期療效不佳，不良反應(yīng)較多，且易產(chǎn)生耐藥性，尋找安全有效的防治方法具有重要的臨床意義[8]。近年來(lái)開(kāi)展了大量的針刺治療DGP的研究，證實(shí)了針刺能有效治療DGP[9]，而有關(guān)灸法的研究較少報(bào)道，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸療法的研究尚處于起步階段，缺乏基礎(chǔ)研究和機(jī)制研究[10]。本實(shí)驗(yàn)擬從食欲興奮劑Ghrelin和食欲抑制劑CCK這一對(duì)互相拮抗的腦腸肽作為研究的切入點(diǎn)，觀察壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸對(duì)DGP大鼠的影響，探討壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸治療DGP的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只6周齡清潔級(jí)SD大鼠,體質(zhì)量(231±10)g，雌雄各半，購(gòu)于長(zhǎng)沙天勤生物公司[SCXK(湘)2014-0011]，所有大鼠均為同一批次，且一般體檢無(wú)異常。大鼠自由飲食攝水，分籠飼養(yǎng)于室溫(22±2)℃，濕度50%～60%，12 h間斷光照的動(dòng)物房。普通飼料和高脂飼料(蔗糖20%、豬油15%、奶粉5%、雞蛋2%、鼠維持飼料58%)，由沈陽(yáng)市前民動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼料廠提供。

1.1.2主要試劑和儀器 鏈脲佐菌素(STZ,美國(guó)Sigma)；甲氧氯普胺片(山西云鵬制藥)；酚紅(天津光復(fù)精細(xì)化工)；大鼠Ghrelin、CCK ELISA試劑盒(南京建成生物工程)；Ghrelin兔抗多克隆抗體(英國(guó)Abcam)；血糖儀及血糖試紙(美國(guó)強(qiáng)生OneTouch)；TGL-18R臺(tái)式離心機(jī)(珠海黑馬)；DYY-12電泳儀、DYCZ-40AZ轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)；AX-X射線(xiàn)攝影暗匣(廣東粵華)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo)；UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津)。

1.2方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表法將80只SD大鼠分為空白組20只和造模組60只，每組雌雄各半。將造模成功后的60只DGP大鼠再次隨機(jī)分成模型組、甲氧氯普胺組、壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組，每組20只。

1.2.2DGP大鼠模型建立 空白組大鼠給予普通飼料，造模組大鼠給予高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周；第9周，造模組大鼠予2%STZ溶液(55 mg/kg)一次性腹腔注射破壞胰島細(xì)胞，并于注射后12、24、72 h采集鼠尾靜脈血測(cè)血糖值，選擇空腹血糖(FGB)≥16.65 mmol/L的成模大鼠納入實(shí)驗(yàn)[11]。

1.2.3實(shí)驗(yàn)方法 空白組、模型組灌胃同體積0.9%氯化鈉溶液；甲氧氯普胺組灌胃同體積1.7%甲氧氯普胺溶液，連續(xù)15 d，每次用藥體積按100 g體質(zhì)量1 mL換算，實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠予普通飼料自由進(jìn)食、飲水。壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組：選取直徑0.7 mm的2號(hào)線(xiàn)(由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供)統(tǒng)一采用重手法點(diǎn)灸，點(diǎn)灸方法參考《壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸學(xué)》[12]按持線(xiàn)-點(diǎn)火-施灸步驟操作，每穴點(diǎn)灸3壯(線(xiàn)頭火星對(duì)準(zhǔn)穴位，一按火滅即起為1壯)，連續(xù)15 d。施灸處方：“中脘”“內(nèi)關(guān)”“足三里”“脾俞”“胃俞”均為雙側(cè)；取穴方法參考李忠仁[13]制訂的“動(dòng)物針灸穴位圖譜”及解剖學(xué)定位。

1.2.4樣品制備和指標(biāo)檢測(cè) 各組大鼠治療15 d后，禁食24 h、禁水2 h，采集大鼠尾靜脈血測(cè)FBG水平，然后用2 mL酚紅溶液(0.5 mg/mL)灌胃，30 min后以10%水合氯醛麻醉大鼠，打開(kāi)腹腔經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，以3 000 r/min離心10 min后取上清液，ELISA法檢測(cè)血清Ghrelin水平。采血結(jié)束后，結(jié)扎賁門(mén)和幽門(mén)，取出大鼠全胃，沖洗胃內(nèi)容物，定容20 mL，加入0.5 mol/L氫氧化鈉20 mL靜置取上清液，再加入20%三氯乙酸去除蛋白，離心取上清液在560 nm波長(zhǎng)紫外分光光度計(jì)下檢測(cè)吸光度值(OD)。用鑷子輕輕取出上至幽門(mén)、下至回盲瓣的小腸管并將小腸拉直鋪于白紙上，用直尺測(cè)量幽門(mén)到酚紅染成紅色末端距離(a)及幽門(mén)到回盲瓣全長(zhǎng)(A)，取二者之比值即為小腸推進(jìn)率。測(cè)量結(jié)束后，從大鼠全胃中剪取小段胃大彎組織，剪碎加PBS制成組織勻漿液，經(jīng)研磨、離心、取上清液，用ELISA法檢測(cè)胃竇CCK水平；另剪取小段胃竇組織置于凍存管，保存在-80 ℃冰箱備用。胃排空率計(jì)算公式如下：

胃排空率=(1-實(shí)測(cè)酚紅OD值/標(biāo)準(zhǔn)酚紅OD值)×100%。

1.2.5Western blot檢測(cè)胃竇組織Ghrelin的表達(dá)水平 取出凍存的胃竇組織，加入RIPA裂解液充分裂解、勻漿、離心提取蛋白，并進(jìn)行電泳、濕轉(zhuǎn)膜，分別加入一抗、二抗，ECL發(fā)光液顯色后將膜置于發(fā)光體系中檢測(cè)、顯影沖洗保存，以目的條帶和β-actin條帶灰度值比值進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠血糖水平比較 造模后與空白組比較，模型組、壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組、甲氧氯普胺組大鼠血糖水平明顯升高(P<0.01);與同組造模前比較，血糖水平也明顯升高(P<0.01)。經(jīng)15 d治療后，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組與模型組相比，血糖水平明顯下降(P<0.01)，且與本組造模后相比，血糖水平也明顯下降(P<0.01)；而甲氧氯普胺組與模型組血糖水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

a：P<0.01，與造模前比較；b：P<0.01，與空白組比較；c：P<0.01，與壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組比較；d：P<0.01，與本組造模后比較

2.2各組大鼠胃排空率與小腸推進(jìn)率比較 與空白組比較，模型組大鼠的胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組、甲氧氯普胺組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率明顯增強(qiáng) (P<0.01)；而壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組與甲氧氯普胺組大鼠胃排空率及小腸推進(jìn)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較

2.3各組大鼠Ghrelin、CCK水平比較 與空白組比較，模型組大鼠血清Ghrelin水平明顯減少(P<0.01)，胃竇CCK水平明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組大鼠血清Ghrelin水平明顯增加(P<0.01)，胃竇CCK水平明顯降低(P<0.01)；與甲氧氯普胺組比較，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組大鼠血清Ghrelin水平增加(P<0.05)，胃竇CCK水平降低(P<0.05)，見(jiàn)圖3、4。

2.4各組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達(dá)水平比較 與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達(dá)明顯降低 (P<0.05)；與模型組比較，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組大鼠胃竇組織Ghrelin蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)；甲氧氯普胺組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.05，與甲氧氯普胺組比較

a：P<0.01，與空白組比較；b：P<0.01，與模型組比較；c：P<0.05，與甲氧氯普胺組比較

A空白組，B模型組，C壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組，D甲氧氯普胺組。a：P<0.05，與空白組比較；b：P<0.05，與模型組比較

3 討 論

近年來(lái)，隨著生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變，糖尿病的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)快速增長(zhǎng)，已成為繼心血管病和腫瘤之外的第三大非傳染性疾病。DGP是糖尿病最常見(jiàn)的胃腸道并發(fā)癥，不僅會(huì)引起頑固性嘔吐、厭食、營(yíng)養(yǎng)不良，而且影響口服藥物吸收變化，造成血糖難以控制，甚至造成餐后低血糖危險(xiǎn)、電解質(zhì)紊亂、難治性糖尿病的發(fā)生[14]。DGP歸屬于壯醫(yī)學(xué)理論的“谷道病”范疇，其病機(jī)是谷道虛損、毒邪阻滯“龍路”、“火路”氣機(jī)、“巧塢”淤滯，其根本治法是調(diào)氣補(bǔ)虛解毒[10]?！白闳铩笔俏钢潞涎?，“合治內(nèi)腑”，擅長(zhǎng)治療胃腸系統(tǒng)疾患；“內(nèi)關(guān)”是止嘔要穴，有和中降逆，消積導(dǎo)滯之效；“脾俞、胃俞”是脾胃二臟的背俞穴，可外散水濕于膀胱經(jīng)，內(nèi)調(diào)脾胃之氣，與胃俞募穴、“腑會(huì)”中脘穴“俞募配穴”，一陰一陽(yáng)，可使清陽(yáng)上升、濁陰下降，恢復(fù)脾胃氣機(jī)升降。有研究表明，使用上述5穴均能增強(qiáng)胃動(dòng)力，改善胃腸功能[15-16]。通過(guò)獨(dú)特壯藥浸泡的壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸以上諸穴，既能發(fā)揮針灸疏通經(jīng)絡(luò)、健脾和胃的作用，又能調(diào)氣補(bǔ)虛、化食解毒，使“壯醫(yī)三氣”復(fù)歸同步。

DGP發(fā)生的本質(zhì)是胃腸功能的紊亂，表現(xiàn)在消化間期推進(jìn)性復(fù)合波(MMC)Ⅲ期消失，餐后胃、十二指腸收縮不協(xié)調(diào)，幽門(mén)括約肌痙攣，胃排空異常[3]；而腦腸肽通過(guò)迷走神經(jīng)介導(dǎo)，可以在中樞和外周途徑上對(duì)胃運(yùn)動(dòng)和胃排空進(jìn)行精細(xì)調(diào)節(jié)，對(duì)胃腸功能的調(diào)節(jié)起重要調(diào)控作用[4,17]。Ghrelin是第一種被證明能刺激進(jìn)食的循環(huán)激素，具有誘發(fā)MMCⅢ期收縮、提高胃竇幽門(mén)協(xié)調(diào)運(yùn)動(dòng)、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)的作用，通過(guò)與其受體GHSR結(jié)合后在中樞和外周途徑發(fā)揮作用[18]。在大腦中，Ghrelin與受體GHSR結(jié)合后激活下丘腦弓狀核(Arc)-外側(cè)隔核Ghrelin神經(jīng)通路[19]、海馬CA1區(qū)-下丘腦Arc Ghrelin神經(jīng)通路[20]，下丘腦外側(cè)區(qū)-延髓迷走神經(jīng)復(fù)合體-迷走神經(jīng)軸等多個(gè)中樞神經(jīng)核團(tuán)，并最終激活神經(jīng)肽Y/刺鼠色蛋白相關(guān)蛋白神經(jīng)元(NPY/AGRP)[21]，上調(diào)胃牽張敏感神經(jīng)元放電活動(dòng)[22]，從而介導(dǎo)胃腸運(yùn)動(dòng)和多食行為；并且Ghrelin受體阻滯劑(D-Lys3-GHRP-6)可完全阻斷上述神經(jīng)通路的激活及胃牽張敏感神經(jīng)元放電效應(yīng)[23]。在外周途徑中，Ghrelin通過(guò)與分布在肌間神經(jīng)叢、黏膜下神經(jīng)叢、迷走神經(jīng)傳入纖維上的GHSR受體結(jié)合促進(jìn)胃酸分泌和胃腸蠕動(dòng)，協(xié)調(diào)胃竇、幽門(mén)與十二指腸運(yùn)動(dòng)，此過(guò)程可被阿托品和迷走神經(jīng)切斷術(shù)所阻斷[24]。

CCK作為一種經(jīng)典的腦腸肽，不僅參與胃腸功能的調(diào)節(jié)，同時(shí)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)飽感信號(hào)產(chǎn)生、食欲調(diào)節(jié)方面有著重要作用[25]。在大腦中，CCK作為一種飽感信號(hào)，通過(guò)激活“下丘腦背內(nèi)側(cè)核(DMH)CCK-NPY”信號(hào)通路，上調(diào)下丘腦室旁核(PVN) 促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子(CRF)基因表達(dá)，抑制Arc NPY表達(dá)，激活外周飽感傳入樞紐阿片黑色神經(jīng)元(POMC)，發(fā)揮控制攝食和能量代謝平衡作用[26-27]；而對(duì)CCK受體基因先天缺失(OLETF)大鼠的研究也表明，CCK受體缺失引起DMH NPY高度表達(dá)促進(jìn)了OLETF大鼠肥胖和糖尿病形成[28]。外周途徑中，CCK一方面與分布在胃竇、幽門(mén)、小腸黏膜上及腸道分支迷走傳入神經(jīng)上的受體結(jié)合，松弛近端胃竇、增加胃的順應(yīng)性，提高幽門(mén)括約肌緊張度，抑制胃竇和近端十二指腸蠕動(dòng)，從而延緩胃排空；另一方面，通過(guò)促進(jìn)膽囊收縮和胰腺分泌，提高胰酶活性，有助于脂肪和蛋白的消化吸收，從而抑制進(jìn)食；并且生理或藥物劑量的CCK均能抑制進(jìn)食后的胃排空[7,29]。

有臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DGP患者往往伴隨著腦腸肽Ghrelin和CCK紊亂，而靜脈注射Ghrelin激動(dòng)劑能明顯改善DGP患者食欲缺乏，對(duì)于結(jié)腸部分切除術(shù)后腸梗阻也有良好的治療效果[30]；此外，靜脈注射CCK能減少肥胖患者攝食量，基于CCK的方法可治療肥胖[31]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，電針足三里等穴可上調(diào)胃竇部Ghrelin、GHSR mRNA表達(dá)，降低胃竇CCK水平[3,32]。本研究結(jié)果顯示，胃腸運(yùn)動(dòng)功能下降與胃竇部Ghrelin和CCK分泌紊亂、Ghrelin蛋白表達(dá)下降相關(guān)，與上述研究結(jié)果一致。并且，經(jīng)壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸干預(yù)后，壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率提高，胃竇Ghrelin水平及蛋白表達(dá)水平增加，胃竇CCK水平下降，提示壯醫(yī)藥線(xiàn)點(diǎn)灸“中脘”等穴改善胃運(yùn)動(dòng)的機(jī)制可能是上調(diào)血清Ghrelin水平并下調(diào)胃竇CCK水平，促進(jìn)Ghrelin在胃竇部蛋白表達(dá)，通過(guò)中樞和外周途徑調(diào)節(jié)腦腸肽分泌紊亂狀態(tài)。然而，這一過(guò)程涉及到的機(jī)制十分復(fù)雜，尚有待后續(xù)進(jìn)一步研究。