楊 勇,陳 霖,楊宏新,李 磊,于 建,何源哈達(dá),楊 晨,徐 偉，高艷偉，高維實(shí)

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤外科，呼和浩特 010017;2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059;3.湖北省宜昌市第一人民醫(yī)院中醫(yī)科 443000；4.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010059；5.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院中西醫(yī)科，呼和浩特 010017)

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，腫瘤的生物治療成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)。近幾年具有亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的外泌體(exosomes)日益受到重視，有學(xué)者預(yù)言外泌體可能會(huì)成為未來(lái)疾病診斷和治療的工具[1]。外泌體源自細(xì)胞并通過(guò)胞吐方式分泌到細(xì)胞外，是具有膜性結(jié)構(gòu)的小囊泡[2]，來(lái)源于不同細(xì)胞的外泌體所含成分也不同，目前已證實(shí)很多類(lèi)型細(xì)胞都能釋放外泌體，但外泌體負(fù)載的抗原物質(zhì)存在很大差異，所以對(duì)不同來(lái)源的外泌體的深入研究對(duì)于腫瘤的個(gè)性化治療顯得非常重要[3]。絲氨酸/蘇氨酸激酶15(serine/threonine kinase 15，STK15)是中心體擴(kuò)增相關(guān)基因，與細(xì)胞有絲分裂相關(guān)，有學(xué)者把其作為中心體擴(kuò)增的標(biāo)記物。早期有學(xué)者認(rèn)為外泌體有抗腫瘤作用，有人推測(cè)其可能會(huì)成為抗腫瘤疫苗[4]，但隨研究的深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)其負(fù)載腫瘤抗原有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用[5-6]，故本研究以胃癌MGC-803細(xì)胞為模型，從其培養(yǎng)上清液中制備胃癌細(xì)胞分泌的外泌體，然后通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞的作用，以及對(duì)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生效應(yīng)的可能機(jī)制，為今后外泌體腫瘤疫苗研發(fā)提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料 人低分化胃癌細(xì)胞株MGC-803為本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)傳代保存。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，二辛可寧酸(BCA)法蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，STK15一抗購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司，鏈霉卵白素-過(guò)氧化物酶(S-P)檢測(cè)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯示試劑盒及多聚賴(lài)氨酸購(gòu)自福建邁新試劑公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 胃癌MGC-803細(xì)胞液氮取出復(fù)蘇后，置于含10%滅活胎牛血清、100 U/mL雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，平均3～4 d傳代1次，所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2外泌體的制備及蛋白定量 胃癌MGC-803細(xì)胞用75 mL培養(yǎng)瓶培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，除去含血清培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3遍，隨后加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后收集上清制備外泌體。(1)收集的上清液1 500 r/min離心10 min，3 500 r/min離心10 min;(2)采用15 000 r/min離心30 min，去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片等物；(3)50 000 r/min離心2 h，用無(wú)菌PBS液稀釋沉淀物、采用濾器除菌(0.22 μm)。首先采用BCA法用標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定得到蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)得外泌體蛋白水平。將沉淀物分裝在小離心管中，取出部分外泌體進(jìn)行電鏡檢測(cè)，其余小管-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3電鏡鑒定外泌體結(jié)構(gòu) 將20 μL外泌體懸液滴加在載樣銅網(wǎng)上，室溫條件靜置1 min后將銅網(wǎng)上多余液體用濾紙從側(cè)面吸干，在銅網(wǎng)上滴加pH值為6.8的磷鎢酸溶液(3%)30 μL，1 min后將磷鎢酸用濾紙吸干，室溫靜置10 min后在透射電鏡下觀察外泌體并照像。

1.2.4胃癌細(xì)胞增殖活力檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞用常規(guī)胰酶消化，PBS洗滌后再制成單細(xì)胞懸液，采用96孔板進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，每孔接種100 μL細(xì)胞懸液(1×104個(gè)/mL)，培養(yǎng)12 h后，分別加入終濃度為0.05、0.10、0.20、0.50 μg/μL的外泌體。實(shí)驗(yàn)設(shè)置實(shí)驗(yàn)對(duì)照組及空白對(duì)照組，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，每孔終體積為180 μL。培養(yǎng)12、24、36、48 h后，每孔加入MTT溶液(5 g/L) 20 μL，孵育4 h后吸棄上清，然后加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，充分混勻。570 nm波長(zhǎng)條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔平均吸光度值。

1.2.5細(xì)胞增殖相關(guān)基因STK15表達(dá)變化 將包被多聚賴(lài)氨酸蓋玻片置于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)12 h待細(xì)胞貼壁后加入濃度為0、0.20、0.50 μg/μL的外泌體。培養(yǎng)24 h后將蓋玻片取出放置于丙酮液中固定15 min，蒸餾水洗滌后，滴加3%的過(guò)氧化氫10 min，PBS洗滌，滴加血清封閉液10 min，滴加STK15一抗(1∶100)，4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。次日PBS洗滌，滴加生物素標(biāo)記的二抗工作液10 min，PBS洗滌，滴加鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化酶10 min，PBS洗滌，滴加DAB顯色液5 min，自來(lái)水沖洗，蘇木精復(fù)染，鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，在顯微鏡下觀察染色結(jié)果。采用彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性反應(yīng)物的灰度值，在40倍視野下每張片子隨機(jī)測(cè)量4個(gè)視野取其平均值代表STK15染色強(qiáng)度。

2 結(jié) 果

2.1外泌體的制備和蛋白定量 胃癌MGC-803細(xì)胞按照上述方法經(jīng)超速梯度離心后得到外泌體，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.653 4X-0.005 8，測(cè)得制備的外泌體濃度為13.39 μg/μL。

圖1 倒置顯微鏡下胃癌MGC-803細(xì)胞(×200)

2.2外泌體的形態(tài)學(xué)鑒定 光學(xué)顯微鏡下可以看到胃癌細(xì)胞呈現(xiàn)梭形、多角形(圖1)，通過(guò)超速梯度離心法從胃癌MGC-803細(xì)胞上清液中得到外泌體，在透射電鏡下觀察到外泌體呈現(xiàn)圓形或橢圓形小囊泡，具有特征性的盤(pán)狀結(jié)構(gòu)，有完整的包膜，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)，直徑為50～130 nm，見(jiàn)圖2。

2.3外泌體對(duì)MGC-803細(xì)胞活力的影響 制備的外泌體與胃癌MGC-803細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)MTT結(jié)果顯示外泌體隨著濃度從0.05、0.10、0.20、0.50 μg/μL升高，570 nm波長(zhǎng)平均吸光度值升高，隨著時(shí)間延長(zhǎng)吸光度值亦升高，通過(guò)方差齊性檢驗(yàn)和方差分析后證實(shí)各時(shí)間節(jié)點(diǎn)的組間增殖活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，外泌體以時(shí)間和劑量依賴(lài)性方式促進(jìn)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖，見(jiàn)表1。

圖2 透射電鏡下的外泌體(×15 000)

a:P<0.05，與0 μg/μL外泌體組比較；b：P<0.05，與0.50 μg/μL外泌體組比較

A:0 μg/μL外泌體組;B:0.20 μg/μL外泌體組;C:0.50 μg/μL外泌體組

圖3 MGC-803細(xì)胞0、0.20、0.50 μg/μL外泌體組中STK15基因表達(dá)(×400)

2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，STK15蛋白陽(yáng)性反應(yīng)物主要定位于細(xì)胞核，部分細(xì)胞質(zhì)也有表達(dá)，陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色顆粒，0.50 μg/μL外泌體的STK5表達(dá)高于0.20 μg/μL外泌體組，0.20 μg/μL外泌體組STK15表達(dá)高于MGC803細(xì)胞組，各組間表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。0、0.20、0.50 μg/μL外泌體組中STK15基因表達(dá)，見(jiàn)圖3。

3 討 論

外泌體作為一種膜性小泡，最初是用來(lái)描述由網(wǎng)織紅細(xì)胞分泌的小囊泡，直徑為30～100 nm，呈現(xiàn)扁球體狀，外膜為磷脂雙分子層，在囊泡表面負(fù)載豐富的膜性分子，這些膜性分子與其功能和來(lái)源相關(guān)[7]。目前認(rèn)為外泌體是由細(xì)胞膜內(nèi)陷形成早期內(nèi)體，早期內(nèi)體的界膜向內(nèi)凹陷出芽形成許多小泡，稱(chēng)之為多泡體(multivesicular bodies，MVB)，當(dāng)MVB膜與細(xì)胞膜融合后，再形成小泡被釋放至細(xì)胞外空間，這種小泡被稱(chēng)之為外泌體。外泌體的膜也是由磷脂雙分子層組成，由于脂類(lèi)分子可以進(jìn)行不間斷運(yùn)動(dòng)，這樣外泌體可與具有膜性結(jié)構(gòu)的物質(zhì)不斷融合來(lái)交換物質(zhì)，蘊(yùn)含的生物信息逐漸被接觸的細(xì)胞所容納。目前人們知道，細(xì)胞之間的信息傳遞過(guò)程非常復(fù)雜，許多細(xì)節(jié)需要詮釋?zhuān)l(shuí)來(lái)扮演細(xì)胞之間的“信使”是目前這個(gè)領(lǐng)域亟待需要解決的難題。外泌體小泡表面負(fù)載活性物質(zhì)很多[8]，腫瘤細(xì)胞源的外泌體，負(fù)載信息更多[2]，作用更為復(fù)雜[9-10]。甚至有學(xué)者認(rèn)為，不同類(lèi)型腫瘤細(xì)胞共表達(dá)的腫瘤共同抗原可能就存在于外泌體囊泡上，外泌體可能以自分泌和旁分泌形式影響癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的信息傳遞[11]。通過(guò)外泌體載體傳遞抗原給抗原呈遞細(xì)胞(如樹(shù)突狀細(xì)胞)，介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞免疫反應(yīng)來(lái)治療同基因源性和異基因源性腫瘤顯示巨大潛力。

有效、安全、穩(wěn)定和實(shí)用是腫瘤理想的治療性疫苗應(yīng)該具備的基本特征。從目前研究結(jié)果看腫瘤源外泌體具有膜的結(jié)構(gòu)特征，大小只有100 nm左右，甚至更小，負(fù)載了腫瘤細(xì)胞的特征分子，具有納米疫苗的特征，可以作為一種新型的亞細(xì)胞疫苗，當(dāng)然其免疫原性、安全性、免疫反應(yīng)性、耐受性等需要在實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。腫瘤源外泌體疫苗，由于其負(fù)載腫瘤相關(guān)抗原多，與細(xì)胞膜有特殊的可融合性，在細(xì)胞間的信息傳遞過(guò)程中發(fā)揮巨大作用，而作為腫瘤疫苗與其他腫瘤肽疫苗、核酸疫苗相比，從理論上可激發(fā)的免疫反應(yīng)更強(qiáng)烈，甚至在上述疫苗無(wú)效的情況下也可能誘導(dǎo)明顯的免疫應(yīng)答。早期有研究報(bào)道當(dāng)接種L1210細(xì)胞分泌的外泌體，移植性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)可部分被抑制；抗腫瘤的T細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)可被來(lái)自熱休克淋巴瘤細(xì)胞的外泌體誘導(dǎo)[12]。王東關(guān)等[13]發(fā)現(xiàn)，樹(shù)突狀淋巴細(xì)胞可被腫瘤源外泌體活化成為特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)，來(lái)殺傷腫瘤細(xì)胞。隨著現(xiàn)代生物科學(xué)的發(fā)展，人們采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)腫瘤細(xì)胞的基因編輯工作更為簡(jiǎn)單，而外泌體作為細(xì)胞分泌的小泡，應(yīng)該負(fù)載基因編輯后腫瘤細(xì)胞的特殊抗原，所以外泌體作為免疫調(diào)控和腫瘤治療的工具或藥物載體顯示巨大潛力[1,14-15]。本研究采用超速離心法制備的腫瘤細(xì)胞外泌體，經(jīng)電鏡證實(shí)具有外泌體的特征。將制備外泌體作用于胃癌MGC803細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，而且隨外泌體濃度增加對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖作用也增強(qiáng)，同時(shí)隨著時(shí)間延長(zhǎng)胃癌細(xì)胞增殖活性也越強(qiáng)，腫瘤源外泌體對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)作用具有時(shí)間和濃度依賴(lài)性。研究結(jié)果提示外泌體負(fù)載重要腫瘤抗原，由其傳遞給抗原呈遞細(xì)胞產(chǎn)生的免疫效應(yīng)可能非常強(qiáng)烈。

STK15基因編碼一類(lèi)絲/蘇氨酸蛋白激酶，是中心體擴(kuò)增相關(guān)激酶，其定位于中心體，位于染色體周?chē)?，是?xì)胞增殖過(guò)程的關(guān)鍵基因[16],在細(xì)胞周期的G1/S期開(kāi)始出現(xiàn)。中心體作為細(xì)胞主要微管組織中心，在細(xì)胞有絲分裂期可形成兩極紡錘體，STK15不僅參與中心體的復(fù)制、分離和成熟，而且還參與紡錘體兩極的組裝與穩(wěn)定性維持。當(dāng)細(xì)胞周期結(jié)束后STK15迅速通過(guò)泛素化降解途徑降解，STK15的精確適時(shí)表達(dá)在細(xì)胞有絲分裂中起重要作用。當(dāng)正常細(xì)胞STK15表達(dá)不容易檢測(cè)到，但細(xì)胞癌變后STK15高表達(dá)，結(jié)果導(dǎo)致多級(jí)紡錘絲形成，染色體不均等分離，遺傳物質(zhì)不穩(wěn)定，出現(xiàn)腫瘤惡性特征。有研究結(jié)果證實(shí)STK15可以轉(zhuǎn)化NTKT3細(xì)胞，使免疫缺陷裸鼠體內(nèi)形成腫瘤，STK15是細(xì)胞增殖過(guò)程的重要標(biāo)志。本研究發(fā)現(xiàn)胃癌MGC803細(xì)胞STK15有少量表達(dá)，加入0.20 μg/μL和0.50 μg/μL濃度的外泌體后，其表達(dá)水平逐漸增高(P<0.05)，而細(xì)胞增殖活性也逐步提高(P<0.05)，胃癌源外泌體攜帶抗原成分可使胃癌細(xì)胞的STK15基因過(guò)表達(dá)，從而加速腫瘤細(xì)胞增殖分裂。研究也提示制備的外泌體充當(dāng)了“信使”，通過(guò)膜分子的相互作用將中心體復(fù)制相關(guān)蛋白傳遞給胃癌細(xì)胞，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖加速。

外泌體最近已經(jīng)成為癌癥和其他疾病中潛在有希望的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物[17]。本研究提示腫瘤源的外泌體或經(jīng)基因修飾后的外泌體可能在腫瘤免疫治療方面具有更大的生機(jī)。有研究表明，在免疫應(yīng)答下調(diào)或誘導(dǎo)免疫耐受過(guò)程中外泌體也在發(fā)揮作用，如外泌體通過(guò)誘導(dǎo)免疫耐受促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[18]，這給腫瘤治療提出新的挑戰(zhàn)，需要深入研究。