余佩瑤,陳傳勝,劉寒冰,鄧艷玲,薛南冬*

(1. 中南林業(yè)科技大學環(huán)境科學與工程學院, 湖南 長沙 410004;2. 中國環(huán)境科學研究院土壤與固體廢物環(huán)境研究所, 北京 100012)

抗生素被廣泛用于畜禽疾病防治[1],而畜禽攝入的抗生素中約30%～90%不能被吸收,以原藥或代謝產(chǎn)物形式隨糞便排出體外[2-4]?？股仉S著糞便農(nóng)用在土壤中累積,通過地表徑流和淋濾等作用影響地表水和地下水環(huán)境,造成土壤和水環(huán)境中抗生素污染,對動植物和微生物產(chǎn)生生態(tài)毒理效應,甚至威脅人類健康[5]。已有調(diào)查顯示,畜禽糞便中存在多種抗生素,四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素含量最多[6]。中國廣東地區(qū)豬糞樣品中喹諾酮類抗生素含量在0.02～1.52 mg/kg之間,磺胺類抗生素總含量在1.90～13.40 mg/kg之間[7];北京地區(qū)采集的雞糞樣品中，四環(huán)素類(土霉素、金霉素和四環(huán)素)含量最高可達23.43、19.03和14.56 mg/kg[8];華東地區(qū)采集的雞糞樣品中，四環(huán)素類和磺胺類抗生素含量最高分別達到354.0和7.10 mg/kg[9]。

畜禽糞便中不同種類抗生素的同時分析檢測對抗生素污染評估和治理具有重要意義[10]。目前,抗生素檢測方法大多針對污水[11-13]、液體食品[14,15]及養(yǎng)殖廢水[16]等液體基質(zhì),對畜禽糞便中抗生素的檢測方法大多研究某一類抗生素[17,18],對不同種類抗生素同時分析檢測的方法也大多按抗生素種類建立,需要分類提取檢測[19,20],主要采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13,21]及高效液相色譜法。前者靈敏度高,但是對復雜的糞便樣品存在較強的基質(zhì)效應,操作復雜且使用及維護成本高。高效液相色譜能使目標物質(zhì)較好分離,且降低了分析成本。因此,建立畜禽糞便中多種類抗生素同時檢測的高效、快速和低成本方法尤為重要。

本研究對固相萃取和高效液相色譜檢測步驟中的相關(guān)參數(shù)進行了優(yōu)化,建立了高效、低成本的固相萃取-高效液相色譜法,對畜禽糞便中常見的6種抗生素進行同時提取檢測。6種抗生素包括常見的四環(huán)素類(土霉素,oxytetracycline, OTC;四環(huán)素,tetracycline, TCT)、喹諾酮類(諾氟沙星,norfloxacin, NOR;恩諾沙星,enrofloxacin, ENR)和磺胺類抗生素(磺胺二甲嘧啶,sulfamethazine, SMZ;磺胺甲惡唑, sulfamethoxazole, SMX)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司); Waters Xterra RP18色譜柱(250 mm×4.6 μm, 5 μm)(美國Waters公司); Oasis HLB柱(3 mL/60 mg)(美國Waters公司); Visiprep TM-DL固相萃取裝置(美國Supelco公司); HITACHICR21GⅡ高速離心機(日本HITACHI公司); DELTA320 pH計(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司); CM-12水浴氮吹儀(北京成蔭偉業(yè)科技有限公司);冷凍干燥機(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)。

標準品:OTC、TCT、ENR、NOR、SMZ和SMX純度均≥99%(百靈威公司)。甲醇(methanol, MeOH)、乙腈(acetonitrile, ACN)、丙酮(acetone, ACE)和二氯甲烷(dichloromethane, DCM)均為色譜純(上海安譜實驗科技股份有限公司)。分析純磷酸、檸檬酸、無水磷酸氫二鈉、EDTA-Na、乙酸(acetic acid)(上海安譜實驗科技股份有限公司)。實驗所用空白雞糞收集于河南某小型養(yǎng)雞場,調(diào)查顯示養(yǎng)雞場未施用過抗生素,實驗室分析結(jié)果也表明該雞糞樣品不含OTC、TCT、ENR、NOR、SMZ和SMX等目標抗生素。實際樣品收集自遼寧省撫順市某小型養(yǎng)雞場。雞糞冷凍干燥,研磨,過1 mm篩待用。

準確稱取6種抗生素標準品各100.00 mg,用甲醇溶解于100 mL棕色容量瓶中,配成質(zhì)量濃度為1 g/L的抗生素標準儲備液,4 ℃冷藏保存。取配制好的標準儲備液各0.1 mL,用10 mL棕色容量瓶配制100 mg/L的混合標準液,并稀釋成50.0、10.0、5.0、1.0、0.5 mg/L的抗生素標準混合溶液。

1.2 樣品處理

準確稱取過篩的雞糞樣品0.50 g,置于50 mL離心管中,加入提取劑EDTA-McIlvaine和有機混合提取液(甲醇-乙腈-丙酮,2∶2∶1, v/v/v)各2.5 mL,渦旋混勻30 s, 30 ℃下超聲15 min,在8 000 r/min下離心15 min,取上層清液于50 mL離心管中,重復以上步驟3次,合并3次提取液,將液體在40 ℃水浴條件下濃縮至5 mL,用超純水定容到10 mL,以降低有機溶劑濃度[21]。過0.45 μm有機濾膜,準備過HLB固相萃取柱進行凈化。

HLB固相萃取柱使用前依次用5 mL甲醇和5 mL超純水活化,保持柱床濕潤,將濃縮液以1 mL/min的流速過柱,用5 mL 5%(v/v)甲醇水溶液淋洗小柱并真空抽干5 min,最后用5 mL甲醇-二氯甲烷(7∶3, v/v)溶液洗脫,收集洗脫液,在40 ℃水浴條件下氮吹至近干,用乙腈-0.7%磷酸(1/9, v/v)定容至1 mL,過0.22 μm有機濾膜待測。

1.3 色譜條件

Waters Xterra RP18色譜柱(250 mm×4.6 μm, 5 μm);柱溫32 ℃;二級陣列管檢測波長為270 nm;進樣體積為10 μL;流速為0.8 mL/min;二元梯度洗脫,流動相A為乙腈,流動相B為0.7%(v/v)磷酸溶液。洗脫程序為:0～20 min, 10%B; 20～35 min, 10%B～18%B; 35～40 min, 18%B～10%B; 40～50 min, 10%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方法

2.1.1提取劑的選擇

抗生素提取劑很多。甲醇、乙腈等有機溶劑因極性相似，可得到較大分配系數(shù)，被廣泛應用于液體中喹諾酮類和磺胺類抗生素的提取[20]。EDTA-McIlvaine緩沖液是常見的雞糞中四環(huán)素類抗生素提取劑[22],可與四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生競爭,有效減少雞糞中金屬離子與四環(huán)素類抗生素中N、O官能團的螯合[23]。針對抗生素的不同性質(zhì)采用不同提取劑,是提高提取效率的關(guān)鍵。為了選擇一種對6種抗生素的同時提取效果最佳的提取劑,本文選擇了不同提取劑M1(EDTA-McIlvaine)[22]、M2(甲醇-乙腈-丙酮,2∶2∶1, v/v/v)[22,24]、M3(乙腈-乙酸,125∶1, v/v)[19]、M4(M1-M3, 1∶1, v/v)和M5(M1-M2, 1∶1, v/v)。加標水平為10 μg/g,平行3次,比較不同提取劑單獨及等比例混合使用時各抗生素的回收率(見圖1)?？梢钥闯?單純以EDTA-McIlvaine緩沖液(M1)或者有機溶劑(M2、M3)作為提取劑時,各類抗生素的提取效率都較低,回收率為21.0%～107.5%、20.7%～69.6%和22.1%～87.8%,說明單獨的無機溶劑或者有機溶劑只能提取雞糞中的小部分抗生素。在M1中加入等體積的酸化乙腈(M4)和有機混合溶液(M5)后,各抗生素的回收率得到改善。比較M4和M5發(fā)現(xiàn),M4雖然整體效果強于M1、M2和M3,但是對于磺胺類抗生素(SMZ、SMX)的提取效果較低,說明加入酸化乙腈只能輕微改變提取劑對磺胺類抗生素的提取效果。而加入有機混合溶液后,M5對各抗生素的提取效果均強于M4,回收率達到70.0%～116.3%之間。這說明單純以EDTA-McIlvaine緩沖液和一種有機溶劑混合并不能同時對多種抗生素達到較好的提取效果,提取劑中多種成分更有利于將雞糞中不同形態(tài)的抗生素提取出來[25]。所以選擇M5為提取劑。

圖 1 不同提取劑下6種抗生素的回收率(n=3)Fig. 1 Recoveries of the six antibiotics withdifferent extractants (n=3)

圖 2 不同pH值下6種抗生素的回收率Fig. 2 Recoveries of the six antibiotics with different pH

2.1.2pH值對固相萃取效果的影響

在固相萃取過程中,目標物離子化程度影響吸附劑的吸附效率,而目標物離子化程度則與pH值有關(guān)。本研究用HCl和NaOH調(diào)節(jié)M5提取液的pH值,比較酸性及中性條件下不同pH值(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0)對6種抗生素添加回收率的影響(見圖2)。加標水平為10 μg/g,不同pH的提取劑提取加標樣品后,過HLB固相萃取柱凈化,以5 mL甲醇洗脫,平行3次。如圖2所示,pH為1～4時,抗生素回收率相差不大;僅pH=3時,目標物回收率略有升高;當提取劑pH為5時,6種抗生素回收率達到最高;pH為5～7時,抗生素的回收率隨pH的增大呈下降趨勢。樣品溶液的pH值影響樣品中分析物的化學形式、穩(wěn)定性以及分析物與固相萃取柱填料之間的相互作用。研究[26]發(fā)現(xiàn),不帶電荷的分析物與HLB固相萃取柱填料之間的作用力更強。磺胺類抗生素(pKa1=1.11～2.75, pKa2=4.18～7.59)[27]有芳香第一胺和磺酰胺基,是具有弱堿性和酸性的兩性電解質(zhì)，在pH=2～5時為中性。喹諾酮類抗生素結(jié)構(gòu)中含哌嗪基,有2個pKa值(pKa1=5.5～6.3, pKa2=7.6～8.5)[28],四環(huán)素類抗生素同樣有2個pKa值(pKa1=3.02～3.30, pKa2=7.40～7.97)[29]。喹諾酮類抗生素和四環(huán)素類抗生素在強酸性條件(pH=1～3)下以陽離子形式為主,回收率較低。在弱酸性條件下(pH=5), 6種目標抗生素均以中性分子為主[30],更有利于達到最佳回收效果。

2.2 固相萃取

2.2.1淋洗液的優(yōu)化

雞糞組成復雜,經(jīng)提取劑提取后,提取液中含有較多雜質(zhì)。因此,需要選擇合適的淋洗液,洗掉附在柱上的雜質(zhì)又不影響目標抗生素的回收。抗生素固相萃取中常用甲醇水溶液作為淋洗液,為了選出合適的淋洗液,比較了不同比例的甲醇水溶液淋洗下抗生素的加標回收率。將抗生素混合標準溶液添加到0.50 g雞糞樣品中,加標水平為10 μg/g,提取步驟同2.1節(jié),濃縮過膜后的提取液通過HLB固相萃取柱,分別用5 mL不同體積分數(shù)(0%、5%、15%、25%)的甲醇水溶液淋洗,抽干5 min后用5 mL甲醇洗脫。如表1所示,15%和25%甲醇水淋洗時,有部分抗生素被洗脫,回收率低于60%;隨著甲醇體積分數(shù)的降低,抗生素回收率逐漸升高;用純水和5%甲醇水溶液淋洗時,各抗生素回收率相差不大。但是純水淋洗后,經(jīng)HLPC檢測雜質(zhì)峰過多,影響目標物的響應值,因此選擇用5%甲醇水溶液淋洗。

表 1 不同體積分數(shù)的甲醇水溶液淋洗后6種抗生素的

圖 3 不同洗脫劑對雞糞中6種抗生素的洗脫效果(n=3)Fig. 3 Effect of different eluents on the elution efficiencies of the six antibiotics in chicken manure (n=3)

2.2.2洗脫劑的優(yōu)化

使用HLB固相萃取柱萃取,柱內(nèi)吸附填料是由親脂性二乙烯苯和親水性N-乙烯基吡咯烷酮兩種單體按一定比例聚合成的大孔共聚物,具有親水性和疏水性基團,通過親水或疏水相互作用力,可以保留多種極性差異較大的化合物,常用于抗生素固相萃取[31]。為了從HLB固相萃取柱上洗脫被吸附的化合物,本文比較了E1(甲醇-乙腈,7∶3, v/v)、E2(甲醇)和E3(甲醇-二氯甲烷,5∶5, v/v)3種有機溶劑的洗脫效果,平行3次。在0.50 g雞糞樣品中加入混合標準品溶液(10 μg/g),提取步驟同2.1節(jié),洗脫劑均為5 mL。結(jié)果表明,甲醇中加入等體積二氯甲烷可以提高6種抗生素的洗脫效果,回收率高于純甲醇的0.3%～21.3%(OTC除外)(見圖3)。在甲醇中加入不同體積的二氯甲烷,發(fā)現(xiàn)當甲醇和二氯甲烷以體積比為7∶3時,各抗生素洗脫效果達到最好,尤其提高了NOR和TCT的回收率,6種抗生素回收率達到70.0%～116.3%(見表2),高于純甲醇的3.3%～21.6%。因此選擇甲醇-二氯甲烷(7∶3, v/v)作為固相萃取的洗脫溶劑。

表 2 不同體積比的甲醇-二氯甲烷對6種抗生素回收率的影響

2.3 色譜條件

2.3.1流動相的選擇

高效液相色譜測定多種抗生素時,調(diào)節(jié)流動相的pH值可以抑制弱堿的解離,進而改變組分的保留時間,改善其分離度。調(diào)節(jié)流動相pH值常用甲酸、乙酸、磷酸和草酸[11,26],本研究分別用0.1%(v/v)的甲酸水溶液與乙腈(MP1)、0.7%(v/v)磷酸水溶液與乙腈(MP2)作為流動相,同時測定6種抗生素。結(jié)果發(fā)現(xiàn),用MP1作為流動相等濃度洗脫,OTC和TCT重合;而采用梯度洗脫時發(fā)現(xiàn),SMX拖尾嚴重,6種抗生素分離效果不好。選用MP2作為流動相梯度洗脫,可以獲得良好的分離效果和適宜的保留時間,峰形尖銳,對稱性較好,無拖尾現(xiàn)象,6種抗生素在30 min內(nèi)可以獲得較好的分離。

2.3.2柱溫的選擇

色譜柱溫度會影響目標分析物的出峰時間及分離效果。溫度升高可以使流動相擴散能力增強,加快了流動相的層流和分析物分子的混合,能有效調(diào)節(jié)柱效。本文研究了30～40 ℃時6種抗生素的分離情況,研究表明,柱溫升高可以明顯加快各抗生素的出峰時間,改善峰形,因為隨著溫度升高,溶質(zhì)的容量因子減小,其減小的程度與溶質(zhì)的焓變有關(guān),焓變越大,溫度對保留的影響越大[32]。當溫度為40 ℃時,目標物出峰時間快,峰形較好,但SMX和ENR出現(xiàn)峰交叉,分離度較差(見圖4a);隨著溫度降低,SMX和ENR開始逐漸分離,目標物出峰時間也相應減慢;到32 ℃時,6種抗生素得到最好的分離效果,且出峰時間穩(wěn)定在30 min以內(nèi)(見圖4b),在批量實驗時可以減少分析時間。

圖 4 不同柱溫下6種抗生素的標準溶液色譜圖Fig. 4 Chromatograms of the standard solution of thesix antibiotics at different column temperaturea. 40 ℃; b. 32 ℃

2.4 線性范圍與檢出限

配制0.5、1.0、5.0、10.0、50.0、100.0 mg/L的系列混合標準溶液,按照前述的色譜條件進行檢測,以色譜峰面積(y)對抗生素質(zhì)量濃度(x, mg/L)作校正曲線后,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(r2)。采用3倍信噪比得出檢出限(LOD), 10倍信噪比得出定量限(LOQ)[25]。結(jié)果見表3,6種抗生素在0.5～100 mg/L范圍內(nèi)具有良好的線性,其r2均≥0.999 9。

2.5 添加回收率及相對標準偏差

分別在0.50 g雞糞樣品中加入5、10、50 μg/g的混合標準溶液,混好的樣品在黑暗條件下靜置24 h,使二者充分接觸,盡量模擬真實樣品。每個添加水平重復3次,按優(yōu)化后的提取方法和色譜條件進行試驗,計算各目標抗生素的添加回收率和相對標準偏差。結(jié)果表明,該方法在低、中、高3個添加水平下的回收率達到70.0%～116.3%之間(見表3),相對標準偏差為1.2%～16.6%。

表 3 6種抗生素的添加回收率、相對標準偏差(n=3)、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

y: peak area;x: mass concentration, mg/L

2.6 實際樣品的檢測

按照上述分析方法對遼寧省撫順市某養(yǎng)雞場雞糞樣品中的6種抗生素含量進行了檢測。通過多點取樣,采集該養(yǎng)雞場當天新鮮雞糞樣品5份,冷凍干燥,研磨過篩后按照上述預處理提取和檢測方法進行分析。結(jié)果表明,雞糞樣品中喹諾酮類和磺胺類抗生素均被檢出。喹諾酮類抗生素因半衰期較長總含量最高,達到1.57～16.92 mg/kg。NOR和ENR均被檢出,含量分別為未檢出～9.23 mg/kg和1.57～7.69 mg/kg?；前奉惪股乜偤吭?.02～13.05 mg/kg之間,其中SMZ的含量為2.02～13.05 mg/kg。SMX、OTC和TCT未檢出。

3 結(jié)論

本研究結(jié)合固相萃取法和高效液相色譜法,建立了一種同時檢測雞糞中四環(huán)素類、喹諾酮類和磺胺類抗生素的方法。該方法高效、低成本,能夠準確地對樣品中的抗生素進行定量分析,適用于畜禽糞便中多種類抗生素的快速檢測,對抗生素污染評估和治理具有重要意義。