王媛媛 楊美青

摘? 要：轉(zhuǎn)錄組通常是指編碼蛋白質(zhì)的信使RNA的總和，隨著測序技術(shù)的不斷進(jìn)步，轉(zhuǎn)錄組測序成為了發(fā)展最為迅猛、應(yīng)用最為普及的一種測序技術(shù)。藥用植物擁有幾千年的應(yīng)用歷史，但是大多數(shù)藥用植物都缺少基因組信息，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以克服這一難點(diǎn)，特別適合藥用植物資源的研究。該文在介紹轉(zhuǎn)錄組測序方法和測序流程的基礎(chǔ)上，綜述了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在藥用植物領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展，主要包括功能基因的發(fā)掘、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和調(diào)控機(jī)制以及SSR分子標(biāo)記的開發(fā)。

關(guān)鍵詞：藥用植物;轉(zhuǎn)錄組學(xué);功能基因;次生代謝產(chǎn)物;SSR分子標(biāo)記

中圖分類號 S567文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 1007-7731（2019）08-0013-04

Abstract：Transcriptome usually refers to the sum of mRNA encoding proteins.With the continuous progress of sequencing technology，RNA sequencing technology has become the most rapidly developed and widely used sequencing technology.Medicinal plants have had thousands of years of application history，but most medicinal plants are lack of gene sequence information，RNA sequencing technology can overcome this difficulty，so this technology is particularly suitable for the study of medicinal plant resources.This paper introduced RNA sequencing methods and sequencing process，and summarized the progress in the application of RNA sequencing technology in medicinal plant functional genes mining，secondary metabolites biosynthesis and regulation mechanism and development of SSR molecular marker.

Key words：Medicinal plants;Transcriptomics;Functional genes;Secondary metabolites;SSR molecular marker

轉(zhuǎn)錄組從廣義上來講，是由1個細(xì)胞或1群細(xì)胞產(chǎn)生的一整套RNA分子，包括mRNA、tRNA、miRNA及其他非編碼RNA;狹義的轉(zhuǎn)錄組一般指所有編碼蛋白質(zhì)的全部的mRNA。植物不同組織、器官，不同發(fā)育階段，不同的生長環(huán)境以及不同的生理狀態(tài)下，其轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)都存在著一定的差異，這些差異對于挖掘功能基因、探究藥用植物有效成分生物合成的分子機(jī)制、開發(fā)新的藥用植物資源及分子輔助育種技術(shù)等都具有重要的意義。因此，將轉(zhuǎn)錄組技術(shù)應(yīng)用于藥用植物的研究是十分必要的[1-4]。隨著高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)與發(fā)展，使得轉(zhuǎn)錄組研究從基因芯片技術(shù)發(fā)展到RNA測序技術(shù)（RNA-seq），也稱為轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。該技術(shù)可以用于任意物種的全轉(zhuǎn)錄組分析，具有低成本、重復(fù)性好、數(shù)字化信號、靈敏度高、檢測范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。近年來，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)展快、應(yīng)用廣，已成為分子生物學(xué)領(lǐng)域中一種常用的測序形式[5]。該技術(shù)最早應(yīng)用于模式植物和重要農(nóng)作物，例如擬南芥[6]、水稻[7]和玉米[8]中，而大部分藥用植物為非模式植物，且大多數(shù)珍稀藥用植物的遺傳背景尚不清楚，基因組信息更是缺乏，功能基因的分子研究尤為薄弱，因此，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在藥用植物中的應(yīng)用相對滯后。本文簡要介紹了轉(zhuǎn)錄組測序的方法和流程，綜述了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在藥用植物功能基因的挖掘、次生代謝產(chǎn)物的生物合成和調(diào)控機(jī)制以及在SSR分子標(biāo)記的開發(fā)3個方面的應(yīng)用進(jìn)展。

1 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)

1.1 方法 本文介紹了4種轉(zhuǎn)錄組測序的常用方法，并分析了其技術(shù)原理、優(yōu)缺點(diǎn)（表1）。

1.2 流程[15] 測序流程如圖1所示：

2 藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的應(yīng)用

2.1 功能基因的挖掘 藥用植物在生長過程中不可避免會遭受到生物和非生物脅迫，加之缺乏優(yōu)良的栽培與品種選育技術(shù)，因而存在著較為嚴(yán)重的品種退化、抗逆性差等問題。為了適應(yīng)特定的環(huán)境脅迫，藥用植物進(jìn)化出多種分子機(jī)制（通過調(diào)節(jié)特定靶基因從而改變其表達(dá)量）來應(yīng)對不同的脅迫。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)可以從整體水平上研究藥用植物的調(diào)控機(jī)制，深入開展藥用植物轉(zhuǎn)錄組的研究，有助于揭示生長發(fā)育過程中的關(guān)鍵影響因素，為藥用植物栽培育種提供指導(dǎo)。Guo等[16]對牡丹進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，共鑒定了81725個單基因和部分植物激素信號通路基因，可能在干旱反應(yīng)中發(fā)揮作用。該研究為干旱相關(guān)候選基因提供了寶貴的資源，為抗旱牡丹品種的選育提供了依據(jù)。Wei等[17]為了對比AtDREB1C轉(zhuǎn)基因丹參和非轉(zhuǎn)基因野生型丹參在抗旱性方面的差異，通過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，AtDREB1C基因可以增加葉綠素含量、光合能力以及超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性，增強(qiáng)植株的抗旱性。該研究為抗旱丹參品種的選育提供了基礎(chǔ)。Li等[18]研究了北沙參在面對鹽脅迫時轉(zhuǎn)錄組的變化，鑒定出10335個差異表達(dá)基因（DEGs），這些基因可能在耐鹽反應(yīng)中發(fā)揮作用。該研究為北沙參的耐鹽分子機(jī)制提供了有用的信息。

2.2 次生代謝產(chǎn)物的生物合成及調(diào)控機(jī)制 隨著色譜法和質(zhì)譜法在中藥材方面的普遍應(yīng)用，對于中藥藥效成分的研究越來越多。其藥效成分通常為次生代謝產(chǎn)物，它的積累與植物不同的發(fā)育階段、不同的器官以及不同的產(chǎn)地息息相關(guān)。根據(jù)不同時期、不同器官、不同產(chǎn)地構(gòu)建藥用植物轉(zhuǎn)錄組文庫，可以從整體水平上研究合成藥效成分的關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況，從而揭開次生代謝產(chǎn)物生物合成的途徑及其調(diào)控機(jī)制的神秘面紗[19]。利用轉(zhuǎn)錄組測序用來研究藥用植物中次生代謝產(chǎn)物生物合成及其調(diào)控機(jī)制具有重要的理論和實(shí)踐意義，為藥用植物資源的種質(zhì)創(chuàng)新提供科學(xué)的依據(jù)，使得藥用植物種質(zhì)資源得到高效的利用。Chahel等[20]通過將轉(zhuǎn)基因技術(shù)、色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)相結(jié)合分析轉(zhuǎn)錄因子LrTCP4對黑果枸杞毛狀根中次生代謝產(chǎn)物合成的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子LrTCP4可以增強(qiáng)枸杞胺A等次生代謝產(chǎn)物的合成，為進(jìn)一步研究其他枸杞的枸杞胺A等物質(zhì)的生物合成提供了依據(jù)。Zhao等[21]利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了與人參皂苷合成相關(guān)的PgCYP基因，共鑒定出100個基因，其表達(dá)與人參皂苷含量顯著相關(guān)，其中6個PgCYP基因含有與人參皂苷生物合成顯著相關(guān)的SNPs/InDels，該結(jié)果對加強(qiáng)人參及其近緣種人參皂苷生物合成研究和育種具有重要意義。Wang等[22]研究了庫頁細(xì)辛468357個轉(zhuǎn)錄本，鑒定出了205165個轉(zhuǎn)錄本存在表達(dá)差異，在這些差異表達(dá)的基因篩選出3個候選轉(zhuǎn)錄本（TyrDC1、TyrDC2和TyrDC3），該研究證明，TyrDC可能是馬兜鈴酸生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，為進(jìn)一步研究其他藥用植物馬兜鈴酸的生物合成途徑奠定基礎(chǔ)。

2.3 SSR分子標(biāo)記的開發(fā) 簡單序列重復(fù)（SSR）是在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的分子標(biāo)記技術(shù)，又稱微衛(wèi)星序列標(biāo)記或短串聯(lián)重復(fù)標(biāo)記。SSR數(shù)量位點(diǎn)十分豐富，甚至可以覆蓋整個基因組，SSR分子標(biāo)記不僅可以應(yīng)用于構(gòu)建植物的遺傳圖譜，在鑒定雜交種的純度、基因定位等方面也有著廣闊的應(yīng)用前景[23]。王海明等[24]從重樓塊根高通量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫38802條Unigenes中共挖掘出6333個SSR分子標(biāo)記，其中二核苷酸重復(fù)是主要富集類型，約為66.76%;三核苷酸重復(fù)次之，約為18.77%;單核酸苷酸重復(fù)約為11.50%;這些SSR標(biāo)記對重樓種質(zhì)資源的鑒定、遺傳多樣性分析和分子標(biāo)記輔助選擇育種具有重要的意義。Han等[25]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從銀杏葉中鑒定出4000個SSR位點(diǎn)，二核苷酸重復(fù)序列的SSRs富集率最高（23.9%），三核苷酸重復(fù)序列的SSRs富集率次之（21%），重復(fù)類型最多的是（AG/CT），檢測到的4000個SSR中，設(shè)計(jì)了1513個SSR的引物對。該研究有助于銀杏的遺傳基因組研究和生物技術(shù)的改進(jìn)。Li等[26]從地黃1747份轉(zhuǎn)錄本中檢測出1812個SSR位點(diǎn)，其中1018份轉(zhuǎn)錄本與已知蛋白具有顯著同源性，35份轉(zhuǎn)錄本為非編碼RNA;在所有SSR位點(diǎn)中，AG/GT是最常見的SSRs重復(fù)類型;合成了279個SSR引物，其中204個在基因組中擴(kuò)增成功，91個多態(tài)性信息含量在0.33～0.90。該研究為今后地黃育種的研究提供了依據(jù)。

3 展望

本文簡要介紹了轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，從功能基因的挖掘、次生代謝產(chǎn)物生物合成和調(diào)控機(jī)制以及SSR分子標(biāo)記開發(fā)等3個層面綜述了近年來藥用植物轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)應(yīng)用方面的進(jìn)展。利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)挖掘功能基因，可以從整體水平上了解藥用植物抗脅迫的調(diào)控機(jī)制，對于藥用植物種質(zhì)資源鑒定、保存、擴(kuò)大與優(yōu)良種質(zhì)選育具有重要的意義。但是由于藥用植物轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究起步較晚，藥用植物研究背景和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)缺乏，因此，今后需要加快藥用植物功能基因組的研究進(jìn)程[27]。藥用植物的藥效成分大都是其次生代謝產(chǎn)物，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以了解其次生代謝產(chǎn)物的生物合成途徑的分子機(jī)制及其合成所需的關(guān)鍵酶基因，為進(jìn)一步研究次生代謝調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，推動了藥用植物次生代謝工程的發(fā)展。將轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)用于鑒定藥用植物的SSR位點(diǎn)、開發(fā)SSR引物，可以構(gòu)建藥用植物的遺傳圖譜，對其進(jìn)行遺傳多樣性分析，也可以進(jìn)一步促進(jìn)分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)的發(fā)展。藥用植物的研究融入轉(zhuǎn)錄組學(xué)，既可以保護(hù)優(yōu)良的中藥材種質(zhì)資源，不斷完善中藥藥效作用機(jī)制，也可以促進(jìn)技術(shù)的不斷發(fā)展，保障中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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（責(zé)編：張宏民）