朱小丹 董若曦 陳 燕 吳曉慧 姚馨怡 許文娟 樊伯珍

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency, POI)指女性在40歲之前卵巢功能衰退的臨床綜合征，以月經(jīng)紊亂(如停經(jīng)或稀發(fā)月經(jīng))伴有高促性腺激素和低雌激素為特征，是一種較為嚴重的威脅生殖健康的疾病。近年來，隨著化學(xué)治療藥物的廣泛使用，化療導(dǎo)致的卵巢損傷成為POI的重要病因。目前對于化療性卵巢損傷的保護，所探索的各種藥物和方法均存在一定的局限性。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是一種存在于葡萄、花生根莖和多種藥用植物中的1,2-二苯乙烯化合物多酚，有較強大的抗氧化功能，能阻止血小板凝聚、防止人體低密度脂蛋白氧化、清除自由基，并能改善修復(fù)卵母細胞損傷，改善卵母細胞質(zhì)量，減輕氧化損傷所致老化和與年齡相關(guān)的疾病[1]。本研究旨在探討白藜蘆醇預(yù)防性應(yīng)用對化療后卵巢組織結(jié)構(gòu)、各級卵泡數(shù)量、內(nèi)分泌功能所起的一系列作用，為臨床腫瘤治療和免疫性疾病中應(yīng)用大劑量的化療藥物時所導(dǎo)致的卵巢損傷，提供有效的保護方法和科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物:近交系雌性Wistar大白鼠，8周齡。體質(zhì)量180～200g，購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院中心實驗室動物房。喂食無特殊病原體(SPF)級鼠飼料及凈化水，室溫20～25℃，相對濕度45%～55%。每日光照12h，飼養(yǎng)1周熟悉環(huán)境后，每日清晨9:00行陰道涂片，顯微鏡下觀察動情周期，選用有正常動情周期的40只大鼠進入實驗。

2.實驗試劑：順鉑凍干粉購自山東齊魯制藥有限公司；白藜蘆醇購自上海祥弘生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫法E2、FSH、AMH試劑盒均購自美國貝克曼庫爾特有限公司。

3.實驗分組及處理：40只雌性Wistar大鼠采用數(shù)字表法隨機分成4組，即對照組、腹腔化療組(CP模型組)、低劑量白藜蘆醇+腹腔化療組(低Res組)、高劑量白藜蘆醇+腹腔化療組(高Res組)，每組10只大鼠。在21天的實驗期間，對照組不給于任何藥物處理，CP模型組給予生理鹽水1ml/d灌胃，低Res組、高Res組則分別給予白藜蘆醇25mg/(kg·d)、75mg/(kg·d)溶于生理鹽水1ml中灌胃。在實驗第15天，除對照組外，其余3組大鼠均稱質(zhì)量后，單次給予順鉑(5mg/kg)，用生理鹽水稀釋至2ml，注射入腹腔內(nèi)。

4.標本提取及檢測：實驗第21天，即順鉑腹腔注射后1周，各組大鼠完成全部給藥后24h，對所有大鼠進行麻醉。取腹主動脈血，于室溫下靜置2h后，3000r/min離心15min。按照酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒說明書進行操作，測定血清E2、FSH、AMH濃度。處死各組大鼠，取出雙側(cè)卵巢稱。卵巢組織脫水后，10%甲醛固定24h，經(jīng)過常規(guī)石蠟包埋。連續(xù)切片厚度5μm，每隔9張即取第10張切片，用蘇木精和伊紅染色。在400倍光學(xué)顯微鏡下觀察卵泡發(fā)育，進行各級卵泡計數(shù):原始卵泡、生長卵泡(初級泡數(shù)+次級卵泡)、成熟卵泡數(shù)量。

結(jié) 果

1.各組大鼠血清激素水平的變化:各組大鼠血清中E2和FSH濃度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。與對照組比較，CP模型組大鼠血清AMH濃度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與CP模型組比較，白藜蘆醇高、低劑量給藥組大鼠血清AMH濃度增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而低Res組和高Res組比較，血清AMH濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠血清E2、FSH、AMH濃度

與對照組比較，*P<0.05;與CP模型組比較，#P<0.05

2.各組大鼠卵巢濕質(zhì)量的變化：取材后稱量大鼠卵巢濕質(zhì)量，與對照組比較，CP模型組大鼠卵巢濕質(zhì)量減輕，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與CP模型組比較，高Res組、低Res組大鼠卵巢濕質(zhì)量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而高Res組、低Res組比較，大鼠卵巢濕質(zhì)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠卵巢濕質(zhì)量

與對照組比較，*P<0.05;與CP模型組比較，#P<0.05

3.各組大鼠卵泡數(shù)目的變化:與對照組比較，CP模型組大鼠原始、生長、成熟卵泡的數(shù)量均明顯減少(P<0.05)。與CP模型組比較，白藜蘆醇高、低劑量給藥組各級卵泡數(shù)均明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，低Res組與高Res組比較，各級卵泡數(shù)量增多，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖1、表3。

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)，通過白藜蘆醇的治療，大鼠血清AMH表達水平的升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義。組織學(xué)檢查顯示，白藜蘆醇能通過保護原始、生長和成熟卵泡，來減少順鉑誘導(dǎo)的卵巢損傷。

圖1 各組大鼠卵巢中的各期卵泡(HE，×200)A.對照組；B.CP模型組；C.低Res組；E.高Res組。原始卵泡；生長卵泡；成熟卵泡

表3 各組大鼠卵巢內(nèi)各期卵泡數(shù)

與對照組比較，*P<0.05；與CP模型組比較，#P<0.05

近年來，隨著化療藥物和靶向治療的進展，腫瘤和免疫性疾病的緩解和治愈率正在穩(wěn)步提高。但化療可能導(dǎo)致卵巢儲備下降，甚至完全性卵巢功能衰竭。順鉑是一種廣泛應(yīng)用的化療藥物，用于治療大多數(shù)類型的癌癥。研究發(fā)現(xiàn)，順鉑可促使人卵巢顆粒細胞的凋亡和原始卵泡的破壞，可導(dǎo)致以卵泡細胞凋亡增加、AMH分泌減少、動情周期紊亂等為特征的卵巢衰竭[2，3]。在化療引起的卵巢損傷中，可通過測定激素如促卵泡激素(FSH)，雌二醇(E2)，抑制素B(inhibit B)和抗苗勒試管激素(AMH)的血漿水平來評估藥物的保護作用[4]。

AMH是一種由小發(fā)育卵泡產(chǎn)生的二聚體蛋白質(zhì)，血漿AMH水平不隨月經(jīng)周期而改變。隨著女性年齡的增長，AMH水平下降，與卵巢儲備能力呈正相關(guān)。相比其他激素，這是一個更為敏感的卵巢儲備指標[5]。Yeh等[6]評估血清AMH和FSH水平、卵巢AMH的表達和卵泡的形態(tài)(一級、二級和竇卵泡)作為生物標志物在順鉑誘導(dǎo)卵巢損傷中的變化，結(jié)果表明AMH在血清及卵巢組織中的表達呈順鉑劑量依賴式降低，這種減少的基本機制和卵泡凋亡的增加有關(guān)。Erba等[7]研究了催產(chǎn)素對順鉑損傷的卵巢組織的治療作用，確定了順鉑導(dǎo)致大鼠血清AMH水平顯著降低。所以，血清AMH水平可作為順鉑誘導(dǎo)卵巢損傷的生物標志物。

本研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射順鉑5mg/kg可顯著減少原始、初級和次級卵泡的數(shù)目，降低血清AMH的水平，證實了順鉑化療對卵泡細胞有毒性作用。Erba等[7]在順鉑治療大鼠中也發(fā)現(xiàn)了原始卵泡數(shù)目明顯下降，并在組織病理學(xué)評估卵泡，發(fā)現(xiàn)順鉑治療損傷大多數(shù)卵泡顆粒層，降低卵泡的完整性，與本研究結(jié)果一致。但本研究中各組大鼠E2和FSH的監(jiān)測未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這可能和大鼠的動情周期，以及E2、FSH的脈沖釋放有關(guān)。

白藜蘆醇是一種多酚類，非類黃酮類抗氧化劑。它是在葡萄皮和高劑量紅葡萄酒中發(fā)現(xiàn)的植物抗毒素[8]。它具有抗炎、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能，通過上調(diào)細胞中的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮抗氧化功能，也對自由基具有直接的破壞作用[9]。Rubiolo等[10]研究發(fā)現(xiàn)，通過用25mg、50mg和75mg劑量的白藜蘆醇可活化抗氧化酶活性，保護受氧化應(yīng)激損傷的原代培養(yǎng)的大鼠肝細胞免受氧化損傷，50mg組的保護效應(yīng)最顯著。Liu等[11]在一項白藜蘆醇對大鼠年齡相關(guān)不孕癥的影響的研究中，將白藜蘆醇30mg/L[約7mg/(kg·d)]加入飲用水中6和12個月，并在白藜蘆醇和對照組中評估卵巢功能和生育力，結(jié)果表明，白藜蘆醇能保護免受年齡相關(guān)的生育力變化，促進卵母細胞數(shù)量和質(zhì)量的恢復(fù)，并保持了健康的卵泡數(shù)量。這些研究發(fā)現(xiàn)支持白藜蘆醇延緩卵巢衰老的假說。

白藜蘆醇的這些作用可能與端粒長度和端粒酶活性增加，與生殖細胞功能障礙減少和SIRT1激活有關(guān)。Kong等[12]研究了白藜蘆醇的作用對不同年齡大鼠卵巢發(fā)育的影響，20mg/(kg·d)的白藜蘆醇處理顯著增加卵母細胞總數(shù)，閉鎖卵泡數(shù)目減少，并抑制了細胞凋亡以及卵泡從原始階段向其他階段的轉(zhuǎn)變階段。Chen等[13]研究了影響中藥多酚對衰老大鼠卵巢儲備的保護作用，并顯示已經(jīng)用白藜蘆醇治療的老鼠4個月有更健康的卵泡和更少的閉鎖卵泡。Atli等[14]研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇治療增加了大鼠發(fā)育卵泡，減少閉鎖卵泡的數(shù)量，并保護卵巢功能抵抗氧化損傷。在本研究中，低Res組給予25mg/kg，高Res組給予75mg/kg白藜蘆醇共21天，第15天給予單次劑量5mg/kg 順鉑腹腔內(nèi)注射。低劑量和高劑量白藜蘆醇組的AMH水平均較順鉑模型組顯著升高。組織學(xué)病理發(fā)現(xiàn)低劑量和高劑量白藜蘆醇組的原始、生長、成熟卵泡均比順鉑組高。

Simsek等[15]研究了白藜蘆醇對全身放射治療引起的大鼠急性卵巢毒性的療效，并表明在照射前施用生理劑量白藜蘆醇(10mg/kg)的總卵泡數(shù)量比對藥物劑量(100mg/kg)具有更大的保護作用。這一發(fā)現(xiàn)被認為與高劑量白藜蘆醇的促凋亡作用有關(guān)。Tseng等[16]報道，100mg/kg劑量的白藜蘆醇誘導(dǎo)大鼠大腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡。同樣，Chao等[17]研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇對人垂體瘤GH3細胞具有濃度依賴性雙相作用，并且表明在較低劑量(1μmol/L)下，白藜蘆醇增加細胞增殖，而在10μmol/L或更高劑量下，誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究中低劑量白藜蘆醇組各級卵泡數(shù)量明顯比順鉑模型組較高。但高劑量白藜蘆醇組的原始、生長、成熟卵泡數(shù)量并沒有明顯低于低劑量白藜蘆醇組，這些結(jié)果可以通過白藜蘆醇的濃度依賴性雙相效應(yīng)來解釋。這項研究表明，適當(dāng)劑量的白藜蘆醇可能通過增加健康卵泡的數(shù)量來保護卵巢功能。

本實驗研究表明，順鉑腹腔化療會破壞大鼠卵巢結(jié)構(gòu)，顯著降低卵巢原始卵泡、生長卵泡和成熟卵泡的數(shù)目，降低血清AMH的濃度水平。而白藜蘆醇，特別是低劑量白藜蘆醇的預(yù)防性使用，能夠減輕順鉑對大鼠卵巢組織結(jié)構(gòu)的破壞及其對卵泡生長過程的抑制作用，促進卵泡生長，增加各級卵泡數(shù)，增強卵巢的儲備能力，其具體的保護機制有待于進一步研究。