叢玲華 鐘國平 陳 鯀 方來福 李 萍

手術(shù)及術(shù)后輔助化療是結(jié)直腸癌患者的主要治療方式，手術(shù)標(biāo)本的病理檢查及病理相關(guān)指標(biāo)檢測在結(jié)直腸癌患者的預(yù)后評估中有重要地位[1]。研究表明，Ang-2是一種新型的血管生成調(diào)節(jié)劑，在腫瘤血管生成中起著至關(guān)重要的作用，CD147通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與間質(zhì)相互作用參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移[2，3]。這兩種標(biāo)志物在腫瘤中的表達(dá)模式對腫瘤患者的預(yù)后可能有重要提示作用。為此，筆者醫(yī)院通過組織芯片技術(shù)對260例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行研究，旨在探討Ang-2和CD147在人結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平及其對預(yù)后的預(yù)測價值，現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1.臨床資料:回顧性分析2012年6月～2016年5月筆者醫(yī)院診治的結(jié)直腸癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床及病理檢查符合《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017版)》中結(jié)直腸癌的診斷；②均于筆者醫(yī)院行結(jié)直腸癌根治術(shù)治療及術(shù)后輔助化療；③新發(fā)患者，無前期治療干擾。排除標(biāo)準(zhǔn)：①無法耐受相關(guān)治療而中途終止治療的患者；②患者依從性較差，無法配合隨訪工作[4]。共納入260例患者，其中，男性139例，女性121例，患者年齡58～75歲，平均年齡66.40±8.50歲，結(jié)腸癌113例，直腸癌147例。根據(jù)12個月內(nèi)的預(yù)后情況，將結(jié)直腸癌患者分為生存組(215例)和死亡組(45例)，并選擇50例結(jié)直腸息肉患者作為對照組，男性28例，女性22例，平均年齡65.63±8.91歲，結(jié)腸息肉43例，直腸息肉7例。

2.治療方案：參照《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2017版)》指南，預(yù)后分期為臨床Ⅰ期的患者行單純手術(shù)治療，臨床Ⅱ～Ⅳ期期患者手術(shù)后分別聯(lián)合單純氟尿嘧啶類、5氟尿嘧啶為基礎(chǔ)的鉑類及鉑類化療聯(lián)合貝伐珠單克隆抗體等靶向治療[4]。

3.研究方法：通過組織芯片技術(shù)及免疫組化方法檢測結(jié)直腸癌患者及對照組的Ang-2蛋白和CD 147蛋白表達(dá)水平。(1)組織芯片制備：由高年資病理醫(yī)師重判每例的HE切片，在結(jié)直腸癌病例的癌組織、結(jié)腸息肉的息肉組織和兩者周圍正常組織各取3個區(qū)域，取樣針直徑1.5mm，設(shè)計(jì)7×6點(diǎn)陣，共42位點(diǎn)，組織芯間距3.0mm。52℃恒溫烤箱融蠟，4℃冰箱存放備用。(2)免疫組化檢查：采用組織芯片系統(tǒng)(Quick-Ray,UT06,韓國UNITMA公司)進(jìn)行分析。組織芯片切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇脫二甲苯、水化。檸檬酸緩沖液(pH值為6.0)加熱至98℃12 min行抗原修復(fù)，分別滴加一抗Ang-2抗體(EPR2891, 美國Abcam公司)和CD147抗體(ab78106,美國Abcam公司)，二抗為通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育30min。染色情況由2名高年資病理病理醫(yī)師分別評估。兩種蛋白的表達(dá)模式為：Ang-2蛋白表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，CD147蛋白表達(dá)于細(xì)胞膜。染色強(qiáng)度分值如下：0分(無染色)、1分(≤20%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)微弱或中等陽性)、2分(>20%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)微弱或中等陽性或<70%的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)完全陽性)、3分(≥70%腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)中等或完全陽性)。陽性細(xì)胞百分比分值為：0分(無細(xì)胞陽性)、1分(<25%細(xì)胞陽性)、2分(25%～75%細(xì)胞陽性)和3分(>75%細(xì)胞陽性)，著色腫瘤細(xì)胞≥1%定義為陽性。最終染色評分由強(qiáng)度分值和陽性細(xì)胞百分比分值相乘而來。

4.評價指標(biāo)：比較結(jié)直腸癌組與對照組患者的一般資料、Ang-2及CD147的表達(dá)差異，不同預(yù)后結(jié)直腸癌患者的一般資料、臨床病理資料及Ang-2及CD147的表達(dá)差異，并比較Ang-2及CD147預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的診斷效能(包括診斷準(zhǔn)確率、敏感度、特異性、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值等)。準(zhǔn)確率=診斷符合人數(shù)/總例數(shù)×100%，敏感度=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%，特異性=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%，陽性預(yù)測值=真陽性人數(shù)/(真陽性人數(shù)+假陽性人數(shù))×100%，陰性預(yù)測值=真陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)+假陰性人數(shù))×100%。

5.隨訪：根據(jù)病案信息每3個月對患者進(jìn)行一次隨訪，終點(diǎn)事件為全因死亡。隨訪時間為12個月，隨訪截止于2017年5月。

結(jié) 果

1.一般資料:結(jié)直腸癌組與對照組患者的年齡、性別、BMI和既往史之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

2.結(jié)直腸癌組與對照組Ang-2及CD147的表達(dá)：結(jié)直腸癌組患者Ang-2及CD147表達(dá)水平明顯高于對照組(P=0.000)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見圖1及表2。

表1 結(jié)直腸癌組與對照組一般資料的比較

圖1 結(jié)直腸癌組與對照組Ang-2及CD147的表達(dá)情況A.結(jié)直腸癌組中腫瘤組織高表達(dá)Ang-2蛋白 (EnVision法，×100)；B.對照組中息肉組織低表達(dá)Ang-2蛋白(EnVision法，×100);C.結(jié)直腸癌中腫瘤組織高表達(dá)CD147蛋白(EnVision法，×200)；D.對照組中息肉組織低表達(dá)CD147蛋白(EnVision法，×200)

3.不同預(yù)后的結(jié)直腸癌患者一般資料的比較：生存組與死亡組患者的年齡、性別、BMI和既往史之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表3。

表2 結(jié)直腸癌組與對照組Ang-2及CD147的表達(dá)情況

表3 不同預(yù)后的結(jié)直腸癌患者一般資料的比較

4.不同預(yù)后的結(jié)直腸癌患者臨床及病理資料的比較：生存組與死亡組患者的腫瘤部位、病理類型、分化程度、臨床分期及治療方式等資料間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生存組Ang-2及CD147表達(dá)分值明顯低于死亡組(P=0.000)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況明顯低于死亡組(P=0.000)，詳見表4。

5.結(jié)直腸癌組織Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的ROC曲線:ROC曲線顯示，應(yīng)用Ang-2及CD147表達(dá)水平對預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后具有較高的診斷效能，其AUC分別為0.821和0.788，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；Youden指數(shù)提示Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的最佳截點(diǎn)分別為≥4分和≥3分，詳見圖2和表5。

6.Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的診斷效能:應(yīng)用ROC曲線所得出的最佳截點(diǎn)，Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的診斷準(zhǔn)確率(81.88%，83.33%)、敏感度(81.30%，82.00%)、特異性(83.33%，87.69%)和陽性預(yù)測值(87.23%，89.23%)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表6。

討 論

結(jié)直腸癌發(fā)生率逐漸上升，發(fā)病年齡日趨年輕化，嚴(yán)重威脅人類健康[5]。雖然手術(shù)切除是治療結(jié)直腸癌的主要方式，但患者術(shù)后的預(yù)后千差萬別[6]。因此，尋找對腫瘤患者預(yù)后有意義的檢測指標(biāo)對預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后及采取治療措施迫切需要。隨著病理技術(shù)的飛速發(fā)展，病理檢測在腫瘤患者的治療方式選擇和預(yù)后評估中占據(jù)著越來越重要的位置，通過病理學(xué)技術(shù)進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物的檢測成為臨床醫(yī)生關(guān)注病情發(fā)展、采取治療措施必不可少的組成部分[7]。尤其是組織芯片技術(shù)的開展，使得病理工作及科學(xué)研究得以大規(guī)模、標(biāo)準(zhǔn)化開展，為腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的研究提供了高效可行的技術(shù)平臺。

表4 不同預(yù)后的結(jié)直腸癌者臨床及病理資料的比較

圖2 Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的ROC曲線

表5 Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的曲線下面積

指標(biāo)最佳截點(diǎn)AUC標(biāo)準(zhǔn)誤差95% CIAng-240.8210.05650.712～0.903CD14730.7880.06960.674～0.877

表6 Ang-2及CD147表達(dá)水平預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后的診斷效能(%)

Ang-2是繼血管內(nèi)皮生長因子之后發(fā)現(xiàn)的一種新的促血管生成因子，它具有內(nèi)皮細(xì)胞特異性，能夠調(diào)節(jié)血管生成，在腫瘤血管形成中起到重要調(diào)節(jié)作用，不僅能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供快速生長所需的充足營養(yǎng)，還通過刺激相關(guān)細(xì)胞因子釋放促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長，在腫瘤進(jìn)展和不良預(yù)后中有重要促進(jìn)作用[8，9]。CD147是一類細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)劑(extracellular matrix metalloproteinase inducer, EMMPRIN)，通過刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的生成進(jìn)而增加細(xì)胞外基質(zhì)和基膜的降解，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供充分條件[10，11]?？梢?，這兩種標(biāo)志物在腫瘤患者疾病進(jìn)展和不良預(yù)后中都有重要的促進(jìn)作用。

本研究通過對2012～2016年260例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組與對照組患者的年齡、性別、BMI和既往史之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但結(jié)直腸癌組患者Ang-2及CD147的表達(dá)水平明顯高于對照組，提示結(jié)直腸癌具有較高的Ang-2及CD147表達(dá)水平。腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的一個重要條件是腫瘤血管形成，Ang-2破壞內(nèi)皮細(xì)胞和周圍基質(zhì)，增加不穩(wěn)定狀態(tài)的血管內(nèi)皮和基質(zhì)對生長因子的敏感度，誘導(dǎo)血管再建和腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞增殖提供保障[12，13]。細(xì)胞外基質(zhì)對腫瘤細(xì)胞的遷移有阻礙作用，CD147通過MMPs，尤其是MMP-2降解細(xì)胞外基質(zhì)，減少腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的天然阻力[14]。由于Ang-2和CD147兩種標(biāo)志物都在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，因此在結(jié)直腸癌中的表達(dá)水平明顯增高。Ismail等[3]和Hyungjoo[1]分別研究了CD147和Ang-2在結(jié)直腸癌患者中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)這兩種標(biāo)志物在結(jié)直腸癌患者中明顯增加，與本研究結(jié)論一致。

此外，生存組與死亡組患者的一般資料(年齡、性別、BMI和既往史)及腫瘤部位、病理類型、分化程度、臨床分期及治療方式等資料間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但生存組Ang-2及CD147表達(dá)分值明顯低于死亡組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況明顯低于死亡組，提示Ang-2及CD147在不良預(yù)后患者中表達(dá)明顯增加，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在不良預(yù)后患者中明顯增多。同時，ROC曲線顯示，應(yīng)用Ang-2及CD147表達(dá)水平對預(yù)測結(jié)直腸癌患者不良預(yù)后具有較高的診斷效能，最佳截點(diǎn)分別為≥4分和≥3分，但Ang-2及CD147的診斷準(zhǔn)確率、敏感度、特異性和陽性預(yù)測值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其原因?yàn)锳ng-2的主要作用是促進(jìn)腫瘤血管生成，新生的腫瘤血管不僅是腫瘤細(xì)胞增殖所必需的內(nèi)部條件，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的第一路徑[15, 16]。CD147主要通過活化 MMP-2降解基膜和細(xì)胞外間質(zhì)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而MMP-2在發(fā)揮作用過程中，還可以釋放促血管生成因子，尤其是血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)，從而促進(jìn)新生血管形成，與Ang-2具有協(xié)同作用。同時，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為腫瘤細(xì)胞的全身播散提供了必要的途徑，是腫瘤患者病情進(jìn)展的標(biāo)志之一，通過Ang-2的促腫瘤血管生成及CD147的細(xì)胞外間質(zhì)講解作用，腫瘤細(xì)胞獲得更多侵襲血管和淋巴管的機(jī)會，大大增加了淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移機(jī)會。因此，Ang-2、CD147及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移三者在結(jié)直腸癌演變和進(jìn)展中即各自發(fā)揮特定作用，又在時間和空間上相互配合，協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞癌變的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。這與Salem等[17]和Farahani等[18]的研究結(jié)果一致。但由于本研究的免疫組化結(jié)果采用半定量分析方法，有一定主觀性，其準(zhǔn)確度、敏感度和特異性尚存在一定誤差，因此有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者Ang-2和CD147表達(dá)水平較高，Ang-2和CD147在預(yù)測結(jié)直腸癌患者預(yù)后中有較高價值，Ang-2≥4分和CD147≥3分可作為提示不良預(yù)后的參考指標(biāo)。