林志堅 董姣璇 程 欣 王怡平 吳 軍

阿魏酸(ferulic acid, 化學(xué)名稱為3-甲氧基-4-羥基丙烯酸)普遍存在于當(dāng)歸、川芎、酸棗仁、蜂膠等中草藥材中，具有抗血小板聚集，解除血管平滑肌痙攣，抗氧化和清除氧自由基，提高膜穩(wěn)定性，以及抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫功能、利肝保濕等藥理作用[1,2]。近年來，阿魏酸鈉在腦梗死的治療作用越來越引起人們的關(guān)注[3]。本研究旨在探討阿魏酸鈉(sodium ferulate，SF)對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能及腦梗死面積的影響。

材料與方法

1.實驗動物與分組:健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級，體重250～300g，50只，由北京大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0010。隨機方法分為5組，即假手術(shù)組、模型組、低劑量SF組、中劑量SF組及高劑量SF組，每組10只。

2.試劑：阿魏酸鈉注射液(中國藥品生物制品檢定研究所)；2%TTC染色液(上海晶美生物科技有限公司)。

3.動物模型的制備：采用傳統(tǒng)改良的大腦中動脈線栓法建立局灶性腦缺血(MCAO)大鼠模型，腹腔注射10%水合氯醛(3ml/kg)進行麻醉，仰臥固定于鼠板上，頸部正中皮膚予強力碘消毒，做一2.5～3.0cm的切口，鈍性分離出右側(cè)頸總動脈及頸內(nèi)、頸外動脈，結(jié)扎頸總動脈和靠近氣管的頸外動脈,然后在頸總動脈分叉下方約3mm處剪一小切口，插入頭端燒成鈍圓形0.25mm尼龍線，大約進入17～20mm,在大腦中動脈起始端堵塞大腦中動脈，然后結(jié)扎固定，縫合切口，在切口及周圍涂布抗生素[4]。假手術(shù)組僅切開皮膚,分離右側(cè)頸總動脈后即縫合。術(shù)后將動物放回清潔的飼養(yǎng)籠中，如果動物死亡則隨機補充造模。

4.給藥方法:(1)假手術(shù)組：僅切開皮膚,分離右側(cè)頸總動脈后即縫合；每日股靜脈滴注等體積無菌生理鹽水。(2)模型組：建立MCAO模型，每日股靜脈滴注等體積無菌生理鹽水。(3)低劑量SF組：建立MCAO模型，每日股靜脈滴注20mg/kg SF共7天。(4)中劑量SF組：建立MCAO模型，每日股靜脈滴注50mg/kg SF共7天。(5)高劑量SF組：建立MCAO模型，每日股靜脈滴注100mg/kg SF共7天。低劑量、中劑量及高劑量SF的濃度參考文獻(xiàn)[5,6]報道確定。

5.神經(jīng)功能評估:運用改良的神經(jīng)功能缺損評分法(mNSS)觀察SD大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化情況，最高分?jǐn)?shù)18分，分?jǐn)?shù)越高提示神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重[7]。

6.腦梗死面積計算：大鼠腹腔注射水合氯醛(4ml/kg)麻醉固定,從背面剪下頭部取出大腦，用0.01mol/L PBS(大約100ml)沖洗后放入-34℃冰箱內(nèi)快速冷凍30min，自腦前極與視交叉連線中點處和漏斗柄與后葉尾極之間，做冠狀切片，每2mm切1片，一般切5～6片，置于2%TTC中，37℃避光水浴20～30min。使用Image J軟件計算腦梗死面積。

結(jié) 果

1.各組治療前后mNSS比較:治療前模型組、低劑量SF組、中劑量SF組及高劑量SF組mNSS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后模型組與低劑量SF組生理鹽水治療后mNSS比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中劑量SF組及高劑量組SF治療后mNSS與低劑量SF組治療后比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后高劑量SF組與中劑量SF組mNSS比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 各組治療前后mNSS比較

與低劑量SF組比較，*P<0.05；與中劑量SF組比較，#P<0.05

2.各組治療前后腦梗死面積的比較:各組大腦TTC染色，假手術(shù)大腦正常組織呈紅色，模型組梗死組織顏色蒼白(圖1)。治療前模型組、低劑量SF組、中劑量SF組及高劑量SF組腦梗死面積，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。治療后模型組與低劑量SF組生理鹽水治療后腦梗死面積比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。中劑量SF組及高劑量組SF治療后腦梗死面積與低劑量SF組治療后比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療后高劑量SF組與中劑量SF組腦梗死面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),詳見表2。

圖1 TTC染色A.假手術(shù)組大腦組織呈紅色；B.模型組大腦梗死組織呈蒼白色(箭頭所示)

組別n治療前治療后假手術(shù)組100.00±0.000.00±0.00模型組1043.27±7.7141.33±6.91低劑量SF1042.44±7.5439.75±6.52中劑量SF1040.87±2.9821.55±5.43?高劑量SF1041.79±3.2618.23±4.99?#

與低劑量SF組比較，*P<0.05；與中劑量SF組比較，#P<0.05

討 論

腦卒中是當(dāng)今威脅人類健康的三大疾病之一，其發(fā)生率、病死率、致殘率均高，在我國位居首位[8]。如何有效的救治腦卒中患者一直是研究的熱點,在有限的時間窗內(nèi)進行靜脈溶栓或者機械取栓可改善患者預(yù)后，但是價格較為昂貴，且偏遠(yuǎn)地區(qū)條件尚未成熟[9]。阿魏酸是桂皮酸的衍生物之一，也是植物來源的一種酚酸，在細(xì)胞壁中與多糖和蛋白質(zhì)結(jié)合成為細(xì)胞壁的骨架。阿魏酸是阿魏、川芎、當(dāng)歸、升麻、木賊、萊菔、酸棗仁等多種中草藥的有效成分之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，中劑量SF組及高劑量組SF治療后mNSS與模型組治療后比較有明顯的下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示中劑量SF及高劑量SF具有改善局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能。SF改善MCAO大鼠神經(jīng)功能具體機制尚未明確，可能從多種途徑發(fā)揮作用。缺血性腦卒中是腦動脈閉塞或者栓塞導(dǎo)致腦組織缺血、缺氧的一種急性腦血管病，其病理生理過程十分復(fù)雜，包括一系列的炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、神經(jīng)細(xì)胞電活動消失、能量代謝障礙、血管再生等[10]。

研究表明，SF可清除氧自由基產(chǎn)生，防止脂質(zhì)過氧化，抑制多種炎性因子形成，從而起到神經(jīng)保護作用。SF也是一種非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，腦缺血、缺氧發(fā)生時，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損后，內(nèi)皮素生成增多。SF可降低血漿內(nèi)皮素的濃度，還可拮抗內(nèi)皮素引起的血管收縮、升壓及血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進一氧化氮的合成，松弛血管平滑肌，擴張血管，改變血液流變學(xué)特征，從而減輕腦缺血損傷程度[11]。腦缺血時神經(jīng)細(xì)胞凋亡除了與氧自由基產(chǎn)生、鈣超載、線粒體損傷等相關(guān)，凋亡過程受基因調(diào)控，已知相關(guān)基因有bc1-2、p53、Fas等基因家族，各種基因在細(xì)胞凋亡過程中作用各不相同，有研究發(fā)現(xiàn)SF能增加bc1-2表達(dá)，減少Bar表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，SF尚能劑量依賴性地降低Par-4及caspase-3基因的mRNA的表達(dá)水平，而過氧化氫通過促進caspase-3及Par-4蛋白的激活來誘發(fā)細(xì)胞凋亡，這可能是SF對抗過氧化氫引起的神經(jīng)毒性的作用機制[12]。

本研究還發(fā)現(xiàn)中劑量SF及高劑量組SF治療后腦梗死面積與模型組治療后比較亦有明顯下降。SF具有減小MCAO大鼠腦梗死面積的作用。急性腦梗死病灶中心區(qū)以神經(jīng)元壞死為主，周圍則是缺血半暗帶(ischemia penumbra)，后者有大量存活的神經(jīng)元，故盡快恢復(fù)缺血半暗帶供血是缺血性腦卒中治療的關(guān)鍵[13]。SF可能通過減少缺血半暗帶神經(jīng)細(xì)胞凋亡，挽救一定數(shù)量的神經(jīng)細(xì)胞，從而減小腦梗死面積。血小板的黏附和聚集以及血栓的形成是缺血性腦卒中形成中重要的病理生理過程，花生四烯酸是血小板活化的重要因素。有研究表明，SF和阿司匹林合用可顯著降低腦梗死患者血漿中血栓素A2(TXA2)與前列環(huán)素(PGI2)的比值,TXA2促進血小板聚集,而PGI2抑制血小板聚集， TXA2與PGI2的比值降低可抑制血小板的活化聚集，對腦梗死的防治具有一定的作用。SF抗血小板聚集、抗血栓形成及縮小梗死面積等作用可能與調(diào)節(jié)TXA2和PGI2平衡有密切關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)，治療后高劑量SF組與中劑量SF組mNSS及腦梗死面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示高劑量SF對局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用及減少腦梗死面積優(yōu)于中劑量組，可能存在一定的量效關(guān)系。本研究的局限性在于僅觀察SF對MCAO大鼠神經(jīng)功能及腦梗死面積的影響，而未進一步從分子角度探討其機制，這也是本課題組今后研究的方向之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)中劑量SF及高劑量SF對局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)具有一定的促進作用，同時也減小腦梗死面積，提示SF在缺血性腦卒中的治療具有一定的治療作用。