江東健，羅秀兒，何慶華,*

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330031）

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是一種常見的真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）產(chǎn)生[1]，此外還有尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）、串珠鐮刀菌（F. moniliforme）、擬枝孢鐮刀菌（F. sporotricoides）、粉紅鐮刀菌（F. roseum）和雪腐鐮刀菌（F. nivale）等亦可產(chǎn)生，DON廣泛存在于大麥、小麥、玉米、燕麥等作物中，是一種全球性污染的真菌毒素[2-3]。

目前，檢測DON的主要方法有薄層層析法[4]、高效液相色譜法[5]、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法、膠體金免疫層析法[6]、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法[7-9]等。其中ELISA法是目前較為常用的真菌毒素檢測方法，該方法是在抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)特異性結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用酶的高效催化作用以放大信號(hào)實(shí)現(xiàn)檢測，具有操作簡便、特異性強(qiáng)和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。然而，傳統(tǒng)的真菌毒素免疫分析體系大多基于競爭型模式，制備真菌毒素全抗原（包被抗原或競爭抗原）是建立競爭型免疫分析方法的前提和關(guān)鍵。目前，傳統(tǒng)的真菌毒素全抗原需以標(biāo)準(zhǔn)品為原料，通過化學(xué)合成的方式，與大分子蛋白偶聯(lián)制備而成，存在制備成本高、批次誤差大且對(duì)環(huán)境具有毒害作用等缺陷。

有鑒于此，尋求制備真菌毒素全抗原替代物用于免疫學(xué)分析的測定已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。近些年來，噬菌體展示技術(shù)在真菌毒素替代物上提供了一個(gè)新的思路。該技術(shù)是將外源編碼蛋白的基因插入到噬菌體衣殼蛋白基因中，然后同衣殼蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)展示外源蛋白的目的[10]。由此，可以通過生物親和淘選得到能和靶物質(zhì)特異性結(jié)合的噬菌體，而且噬菌體具有快速大批量的生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。Xu Yang等[11-12]將橘霉素（citrinin，CIT）特異性單克隆抗體作為靶標(biāo)，從天然羊駝抗體庫及天然駱駝抗體庫分別淘選得到CIT的噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體，替代傳統(tǒng)的CIT化學(xué)合成抗原應(yīng)用于免疫學(xué)分析體系，實(shí)現(xiàn)CIT的綠色免疫分析。Wang Xianxian等[13]將玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）特異性單克隆抗體作為靶標(biāo)，從天然羊駝噬菌體展示納米抗體文庫淘選得到ZEN的噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體，實(shí)現(xiàn)了免疫學(xué)分析ZEN的無毒檢測。Ji Yanwei等[14]將赭曲霉毒素A（ochratoxin，OTA）特異性單克隆抗體作為靶標(biāo)，從駝源天然納米抗體文庫淘選得到OTA的噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體，替代傳統(tǒng)的OTA人工合成抗原，建立OTA環(huán)境友好型的免疫檢測方法。He Zhenyun等[15]將OTA特異性單克隆抗體作為靶標(biāo)，從噬菌體展示隨機(jī)十二肽庫和環(huán)七肽庫淘選得到7 株OTA的噬菌體展示模擬表位，替代傳統(tǒng)的OTA人工抗原，實(shí)現(xiàn)了OTA的無毒免疫分析。He Qinghua等[16]將ZEN特異性單克隆抗體作為靶標(biāo)，從噬菌體展示十二肽庫淘選得到5 株ZEN的噬菌體展示抗原模擬表位，很好地應(yīng)用于ZEN的綠色免疫學(xué)分析。此外，Shu Mei[17]和Wang Yanru[18]等分別得到了伏馬菌素B1（fumonisin B1，F(xiàn)B1）和黃曲霉毒素B（aflatoxin，AFB）的抗獨(dú)特型抗體?？躬?dú)特型抗體可以模擬抗原的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)又與天然抗原競爭，可以作為良好的抗原模擬物用于免疫學(xué)分析。

熒光定量免疫聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法是20世紀(jì)90年代被開發(fā)出來的一項(xiàng)技術(shù)，該方法結(jié)合了抗原抗體免疫學(xué)反應(yīng)強(qiáng)特異性和PCR高擴(kuò)增的敏感性，一定程度上彌補(bǔ)了ELISA方法不適用于小分子、示蹤物質(zhì)及低濃度樣本的定量檢測。Sano等[19]在1992年建立了一種新型的檢測技術(shù)即免疫PCR，該方法是將特異性抗體和核酸分子偶聯(lián)，用核酸作為標(biāo)記物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以達(dá)到放大信號(hào)的目的。由于PCR的超高擴(kuò)增效率使得該方法的靈敏度有幾個(gè)數(shù)量級(jí)的提升，很大程度上解決了很多物質(zhì)的微量檢測問題[20-22]。然而，該類方法由于需要特異性抗體和核酸分子的偶聯(lián)過程，不僅操作耗時(shí)、繁瑣，而且破壞了抗體及DNA的活性。近年來，研究者們開發(fā)出一種新型的噬菌體展示-免疫PCR方法，利用噬菌體展示技術(shù)將特異性抗體和其核酸序列直接聯(lián)系在一起，可直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，省去了特異性抗體和核酸分子偶聯(lián)的繁瑣過程。Liu Yuanyuan等[23]基于抗Cry1Ac噬菌體展示納米抗體建立的定量免疫PCR檢測Cry1Ac方法，最低檢出限為0.1 pg/mL。Lei Jiawen等[24]基于抗AFB的噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體建立定量免疫PCR檢測谷物和飼料中的AFB，最低檢出限為0.02 ng/mL。抗獨(dú)特型納米抗體作為無毒試劑的替代和PCR的高擴(kuò)增敏感的信號(hào)放大作用可以使檢測的安全性和靈敏度大大提高。目前，應(yīng)用該方法進(jìn)行DON檢測的文獻(xiàn)鮮見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，已從駝源天然納米抗體庫中淘選出1 株鼠源DON單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體[25]。該噬菌體顆粒既可以作為檢測抗原用于免疫學(xué)分析，同時(shí)噬菌體顆粒內(nèi)包裹的DNA又可以作為DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增?；谶@個(gè)原理（圖1），本研究根據(jù)鼠源DON單克隆抗體特異性結(jié)合的噬菌體展示抗獨(dú)特型抗體，建立一種基于噬菌體展示納米抗體的高靈敏、特異性檢測DON的免疫熒光定量PCR方法。該方法直接使用噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體作為競爭抗原的替代物，應(yīng)用于免疫PCR體系，避免了使用傳統(tǒng)的化學(xué)合成酶標(biāo)抗原所帶來的環(huán)境污染、操作毒性等缺陷，在食品安全尤其是在真菌毒素、致病菌[26]、農(nóng)藥殘留[27]、轉(zhuǎn)基因食品以及腫瘤標(biāo)記物[28-29]的綠色靈敏檢測方面具有廣泛的應(yīng)用前景。

圖 1 基于噬菌體展示納米抗體的定量免疫PCR原理示意圖Fig. 1 Schematic diagram of phage displayed nanobody based real-time immuno-PCR

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DL2000 DNA Marker、SYBR熒光定量PCR試劑盒日本TaKaRa公司；Goldview核酸染料 北京索萊寶科技有限公司；抗DON單克隆抗體、抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體（P-28）由本實(shí)驗(yàn)室自制；DON標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司；HRP酶標(biāo)記的抗M13二抗 美國GE Healthcare公司；E.coli TG1由本實(shí)驗(yàn)室保存；BSA、OVA 生工生物工程（上海）有限公司；96 孔聚丙烯PCR板 美國ABI公司；20% PEG/NaCl溶液（141.1 g NaCl+200 g PEG8000，去離子水定容至1 L）；0.1 mol/L Gly-HCl溶液（0.75 g甘氨酸+2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH 2.2，去離子水定容至100 mL）；2 mol/L Tris-HCl溶液（48.44 g Tris+HCl調(diào)節(jié)pH 8.5，去離子水定容至200 mL）；0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（KH2PO40.27 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.58 g，5 mol/L NaOH溶液調(diào)pH 7.4，加超純水定容至1 L）；0.05% PBST（1 L 0.01 mol/L PBS+0.5 mL Tween-20）；TMB顯色液；2 mol/L H2SO4終止液（10 mL 98%的H2SO4+80 mL超純水）；LB培養(yǎng)基（5 g酵母提取物，10 g細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，10 g NaCl定容至1 L超純水）；LB/Amp平板（LB培養(yǎng)基+15 g/mL瓊脂粉+0.1 mmol/L Amp）；Bind/Wash Buffer（20 mmol/L Na2HPO4·12H2O，0.15 mol/L NaCl，pH 8.0，真空抽濾）；Elution Buffer（0.1 mol/L甘氨酸，pH 2.5，真空抽濾）；中和Buffer（1 mol/L Tris-HCl，pH 8.5，真空抽濾）。

1.2 儀器與設(shè)備

ECO0.9型超凈工作臺(tái) 美國Thermo公司；微量移液器 芬蘭Labsystems公司；HQL150B大幅度恒溫?fù)u床上海智城分析儀器制造有限公司；CFX96 realtime PCR儀美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 抗DON單克隆抗體的純化

取出Protein G親和層析柱，豎直固定上樣管于鐵架臺(tái)，關(guān)閉活塞；預(yù)先加入1 mL的Bind/Wash Buffer至層析柱中，充分搖勻，加入1 mL的勻漿，靜置15～30 min。加入5 mL Bind/Wash Buffer到柱中，流速約為1 mL/min，流凈后關(guān)閉活塞，加入用Bind/Wash Buffer 1∶1稀釋的DON單克隆抗體腹水，室溫靜置30 min，流速約為1 mL/min，收集流穿液。加入30 mL Bind/Wash Buffer，流速約為2 mL/min，收集洗滌液，洗雜后，加入10 mL Elution Buffer流速約為1 mL/min，收集洗脫液，然后用1/10體積的中和Buffer調(diào)節(jié)pH 7.4。加入10 mL Bind/Wash Buffer洗滌柱子，關(guān)閉活塞，加入10 mL含20%乙醇溶液的Bind/Wash Buffer，4 ℃保存。

1.3.2 抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體（P-28）的擴(kuò)增

P-28劃線于LB/Amp平板培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種于5 mL LB/Amp培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)6 h。1%的接種量接種于25 mL LB/Amp培養(yǎng)基，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD值0.35～0.5左右；加入輔助噬菌體 M13KO7（感染復(fù)數(shù)1∶1），37 ℃靜置孵育15 min后轉(zhuǎn)至搖床，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)45～60 min。培養(yǎng)液在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，25 mL LB/Amp/Kana培養(yǎng)基重懸菌體，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)6 h。4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取上清液，加入1/5體積的PEG/NaCl，冰上靜置4 h以上；菌液在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，用1 mL 1×PBS懸浮噬菌體，加入1/5體積的PEG/NaCl ，冰上孵育1 h，4 ℃、8 000 r/min離心10 min，棄上清液，250 μL 1×PBS重懸噬菌體并測滴度。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28的VHH片段FR3-CDR3區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，并由南京金斯瑞公司合成。引物序列如下：P28-F 5’-3’ ACT ATA TAG ACT CCG TGA AGG G（22 bp）；P28-R 5’-3’ AGC ACT ATA AGG TAC TGT CGA AC（23 bp）。

1.3.4 引物驗(yàn)證

將合成的引物擴(kuò)增抗DON單抗的噬菌體陽性克隆，以P-28為模板進(jìn)行普通PCR。反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 2 μL，dNTPs（2.5 mmol/L）1.6 μL，Mg2+1.2 μL，P28-F 0.5 μL，P28-R 0.5 μL，模板0.5 μL，Taq酶0.15 μL，ddH2O 13.55 μL，反應(yīng)體系共計(jì)20 μL。PCR條件如下： 95 ℃變性10 min；退火、延伸（95 ℃、1 min，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s）×30；72 ℃、10 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳后，于紫外成像儀下觀察結(jié)果并拍照。1.3.5 PCR退火溫度的優(yōu)化

以P-28噬菌體為模板，P28-F、P28-R為特異性引物，進(jìn)行定量PCR，實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)88 孔，各行設(shè)置梯度退火溫度：55～65 ℃；各列設(shè)置梯度噬菌體數(shù)量1010、109、108、107、106、0，定量PCR體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL，P28-F（10 μmol/L）0.5 μL，P28-R（10 μmol/L）0.5 μL，P-28噬菌體6 μL，ddH2O 3 μL，反應(yīng)體系共計(jì)20 μL。PCR條件：變性95 ℃、10 min；退火95 ℃、30 s，55～65 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；循壞后添加溶解曲線。

1.3.6 定量PCR檢測DON方法的建立

用抗DON的單克隆抗體（10 μg/mL）包被96 孔酶標(biāo)板，4 ℃孵育過夜，PBST洗板4 次，加入300 μL/孔4%的脫脂牛奶-PBS封閉，37 ℃孵育2 h，PBST洗板4 次。加入50 μL梯度質(zhì)量濃度的DON標(biāo)品（1 000、100、10、1、0.1、0 ng/mL）/待測樣品和50 μL P-28（1∶3 200），PBST洗板4 次，加入100 μL 0.1 mol/L Gly-HCl（pH 2.2），水平搖床振蕩孵育10 min后用移液器吸出，加入10 μL 2 mol Tris-HCl進(jìn)行中和，移液器吹打數(shù)次混勻，取6 μL中和液進(jìn)行定量PCR。定量PCR體系：2×SYBR Premix Ex Taq 10 μL、P28F（10 μmol） 0.5 μL、P28R（10 μmol） 0.5 μL、P-28噬菌體6 μL、加超純水至20 μL。定量PCR條件：變性95 ℃、10 min；退火95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，延伸72 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)；循環(huán)后添加溶解曲線。

1.3.7 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取1 g空白玉米樣品，分別加入1、10、100、1 000 μg/kg的DON，然后加入10 mL PBS提取液，置于渦旋振蕩器上充分振蕩15 min，8 000 r/min離心20 min，收集上清液，按1.3.6節(jié)所述方法進(jìn)行DON含量的測定，計(jì)算加標(biāo)回收率及變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗DON單克隆抗體的純化

固相親和淘選是以純度高的抗DON單克隆抗體作為靶體，得到與之特異性結(jié)合并能與DON標(biāo)準(zhǔn)品競爭結(jié)合抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28，因此純度較高的抗DON單克隆抗體與噬菌體展示納米抗體P-28結(jié)合活性較好。故本實(shí)驗(yàn)采用金斯瑞Protein G親和層析柱法對(duì)抗DON單克隆抗體腹水進(jìn)行純化，純化后抗體的SDS-PAGE分析如圖2所示，在洗脫液中55 kDa和25 kDa處各有一條清晰的條帶，分別為抗DON單克隆抗體的重鏈與輕鏈?？笵ON單克隆抗體的純度較高。

圖 2 免疫親和層析柱法純化的抗DON單克隆抗體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of anti-DON monoclonal antibodies purified by immuno-affinity chromatography

2.2 引物的驗(yàn)證結(jié)果

P-28是基于噬菌體展示文庫淘選出來的抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體，為建立DON的熒光定量PCR檢測方法，依據(jù)P-28 VHH編碼基因FR3-CDR3區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物。利用普通PCR方法對(duì)引物進(jìn)行驗(yàn)證，將rTaq酶擴(kuò)增后的反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，于凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖3所示，獲得目的條帶為149 bp，成功擴(kuò)增出目的序列，表明該引物可以進(jìn)行熒光定量PCR的后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖 3 噬菌體展示納米抗體P-28 VHH編碼基因FR3-CDR3區(qū)PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳分析Fig. 3 Agarose gel electrophoresis analysis of PCR amplified FR3-CDR3 region of the VHH encoding gen of phage displayed nanobody P-28

2.3 定量PCR退火溫度的優(yōu)化

采用梯度PCR的方法，設(shè)置模板數(shù)梯度（106、107、108、109、1010PFU/mL）和退火溫度梯度（55～65 ℃），配制PCR體系后進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，定量PCR特異性良好，熔點(diǎn)曲線只存在單一峰（圖4）。P-28噬菌體定量PCR擴(kuò)增曲線如圖5所示，作出每個(gè)退火溫度下，模板數(shù)的對(duì)數(shù)（X）與Ct值（Y）的相關(guān)性曲線，如表1所示，起始模板數(shù)越多，Ct越小，并且每個(gè)模板的Ct值與模板數(shù)的對(duì)數(shù)值存在線性關(guān)系。對(duì)比不同退火溫度下的相關(guān)系數(shù)R2和擴(kuò)增效率，當(dāng)退火溫度65 ℃時(shí)，R2為1且擴(kuò)增效率達(dá)96.33%，表明在退火溫度65 ℃條件下，PCR的穩(wěn)定性和重復(fù)性較好。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，退火溫度均設(shè)為65 ℃。

圖 4 P-28噬菌體定量PCR熔點(diǎn)曲線峰圖Fig. 4 qPCR melting point curve for P-28 phage

圖 5 不同退火溫度下噬菌體模板的定量PCR擴(kuò)增曲線圖Fig. 5 qPCR amplification curves of phage template at different annealing temperatures

表 1 不同退火溫度下噬菌體模板數(shù)與Ct值的線性方程Table 1 Standard curves of phage template at different annealing temperatures

2.4 定量PCR檢測DON方法的建立

基于抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28，建立基于間接競爭的定量免疫PCR檢測DON的方法。本研究通過方正滴定方法確定最佳DON單克隆抗體包被質(zhì)量濃度為10 μg/mL，噬菌體的稀釋倍數(shù)為1∶3 200，抗原、抗體的反應(yīng)時(shí)間為1 h。再在此條件下建立免疫熒光PCR檢測DON的標(biāo)準(zhǔn)曲線，基于噬菌體展示納米抗體P-28定量PCR檢測DON的擴(kuò)增曲線如圖6所示，然后以DON標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)值（x）為橫坐標(biāo)、Ct值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性方程為y=24.11+0.51x，相關(guān)系數(shù)R為0.995。

圖 6 基于噬菌體展示納米抗體定量PCR檢測DON的擴(kuò)增曲線圖Fig. 6 Amplification curves for qPCR detection of DON based on phage displayed nanobody

本研究建立的免疫熒光PCR方法的線性范圍為0.1～1 000 ng/mL，IC50值為（3.96±2.21）ng/mL，最低檢出限為0.048 ng/mL，擬合曲線相關(guān)系數(shù)R2為0.996，組間誤差、批間誤差、日間誤差分別為4.2%、6.2%、8.9%（n=3）。采用間接競爭ELISA測定P-28的特異性，加入其他4 種常見的真菌毒素FB1、ZEN、AFB1和OTA，進(jìn)行間接競爭分析，P-28與其他4 種真菌毒素均無明顯交叉反應(yīng)，表明該方法對(duì)DON定量檢測特異性良好。

2.5 加標(biāo)回收率驗(yàn)證結(jié)果

為驗(yàn)證所開發(fā)方法的可靠性，本實(shí)驗(yàn)向陰性的玉米樣品中添加不同質(zhì)量濃度的DON標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)PBS提取后，進(jìn)行定量免疫PCR分析，結(jié)果如表2所示，該方法用于檢測DON的加標(biāo)回收率為90.7%～108.3%，變異系數(shù)為7.22%～13.89%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。

表 2 基于噬菌體展示納米抗體的綠色免疫PCR分析DON的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)Table 2 Recovery of DON from spiked corn by phage displayed nanobody-mediated green immuno-PCR

3 討 論

噬菌體展示-免疫PCR方法采用噬菌體粒子作為檢測抗原或者抗體，同時(shí)也提供在噬菌體展示-免疫PCR擴(kuò)增過程中的DNA模板。由于熒光染料的存在，隨著PCR的進(jìn)行，雙鏈PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，熒光染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合使得熒光信號(hào)以指數(shù)形式不斷放大，這一信號(hào)放大過程使得此方法的靈敏度和線性范圍得到了顯著改善。

本研究針對(duì)噬菌體展示納米抗體技術(shù)淘選出來的抗DON單抗的噬菌體展示抗獨(dú)特型納米抗體P-28，建立了一種高靈敏、特異性檢測DON的熒光定量PCR的檢測方法，IC50值為從傳統(tǒng)的噬菌體ELISA值（77.89±1.77）ng/mL[25]降低至（3.96±2.21）ng/mL，最低檢出限為0.048 ng/mL，線性范圍從21.14～316.52 ng/mL[25]擴(kuò)寬到0.1～1 000 ng/mL。相比于傳統(tǒng)phage-ELISA檢測方法，此方法提高了DON的檢測靈敏度及檢測范圍。同時(shí)，本研究將抗DON單抗的噬菌體展示納米抗體P-28用于替代小分子抗原用于免疫學(xué)檢測，降低了因引入DON標(biāo)準(zhǔn)品制備全抗原對(duì)人體的毒害和環(huán)境的污染，提高了產(chǎn)品的應(yīng)用價(jià)值[30]，因此在食品安全尤其是真菌毒素檢測領(lǐng)域的應(yīng)用具有廣泛的應(yīng)用前景。