劉 飛，李戈銳，張家瑜，徐 倩，楊福忠，李 明，史習(xí)剛，謝春華，席在星

(1.湖南文理學(xué)院，環(huán)洞庭湖水產(chǎn)健康養(yǎng)殖及加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德 415000；2.湖南省漢壽縣特種水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南常德 415000；3.大湖水殖股份有限公司，湖南省水產(chǎn)工程技術(shù)研究中心，湖南常德 415000)

中華鱉(Pelodiscussinensis)，屬爬行綱(Repitlia)龜鱉目(Testudinata)鱉科(Trionychidae)鱉屬(Pelodiscus)，是我國南方重要的養(yǎng)殖品種，尤以地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品“漢壽甲魚”著名[1-2]。雄性中華鱉具有生長速度快、裙邊厚實(shí)、可食比例高的特點(diǎn)，為商品鱉養(yǎng)殖優(yōu)先選用；因種質(zhì)資源退化和原生境破壞，雌性中華鱉為原良種保護(hù)和繁育所需[3-4]。因此，對于中華鱉的性別分化研究除了理論意義外[5～7]，還具有較大的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

已有很多研究工作表明，在24～32 ℃孵化環(huán)境中，隨溫度升高，中華鱉雌性比率降低，雄性比率升高，胚胎的孵化率提高，孵化周期也就越短。中華鱉性別決定為溫度依賴型(temperature dependent sex determination, TSD)[8]，但也有研究指出中華鱉存在微小性染色ZW，屬于基因型性別決定機(jī)制(genetic sex determination, GSD)[9]。當(dāng)前，中華鱉胚胎分化的研究重點(diǎn)在雄性化誘導(dǎo)，主要方法有3種：一是孵化溫度控制；二為性激素和化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)；三是溫度和激素集合處理[10～13]。這3種方法需人工操作，設(shè)施設(shè)備要求多，工作量大，效果不穩(wěn)定。目前，有關(guān)中華鱉胚胎的雌性化誘導(dǎo)工作報(bào)道極少，對除溫度、濕度外的其他環(huán)境因子影響中華鱉性別決定和性腺分化的報(bào)道也極少。

本研究擬采用物理手段(孵化基質(zhì)、磁、聲、光等)影響中華鱉胚胎性別分化方向，試圖找到安全、有效、簡便的方法改變中華鱉孵化性比和提高孵化率，為中華鱉的人工繁育和種質(zhì)資源保護(hù)工作提供理論與技術(shù)上的參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源和孵化環(huán)境

孵化實(shí)驗(yàn)在湖南省漢壽縣特種水產(chǎn)科學(xué)研究所中華鱉良種場于2017年7月中旬-9月上旬進(jìn)行。早上自親鱉池塘旁的產(chǎn)卵沙場中收集鱉卵(蛋)，挑選受精卵排列放置于孵化房子的塑料盆，待第二天孵化實(shí)驗(yàn)用。

在4間18 m2蓋瓦單層紅磚房(3 m×6 m×3 m)內(nèi)進(jìn)行室內(nèi)環(huán)境孵化，無加溫措施。實(shí)驗(yàn)期每日上午與晚上各記錄一次空氣和基質(zhì)中的溫度、濕度；整個夏季，孵化室內(nèi)溫度在23～38 ℃，平均為28.7 ℃；空氣相對濕度在62%～82%，平均為75.7%；孵化基質(zhì)含水量保持在在8%左右；孵化基質(zhì)溫度在24～36 ℃，平均29.3 ℃。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)所用木箱(50 cm×40 cm×10 cm)底層均鋪設(shè)3 cm土壤，其中磁場處理組所用木箱底部內(nèi)面固定了10塊扁平磁鐵(190 mm×70 mm×18 mm)，實(shí)驗(yàn)磁場為非均勻性非電流靜磁場，鐵氧永磁體型磁鐵來自徐州市恒通磁鐵公司。受精卵(蛋)按動物極朝上間隔排列整齊后，覆蓋不同孵化基質(zhì)(土壤或蛭石)。依據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《中國土壤分類與代碼》(GB/T 17296—2000)，實(shí)驗(yàn)所用土壤種類為紅壤類(A13)典型紅壤亞類(A131)灰泥質(zhì)紅壤屬(A13117)中的灰紅沙土(A1311712)，是發(fā)育于石灰?guī)r等碳酸巖類殘坡積物母質(zhì)的土壤。土壤粒徑在0.05～0.02 mm；蛭石粒徑在 0.1～0.3 mm。基質(zhì)含水量在6%～10%。每個木箱中受精卵總數(shù) 390～430個，受精卵間間距大約為0.5 mm。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為3組，每組處理和對照各設(shè)計(jì)3個平行：第1組和第2組為磁場N極處理組(CN)和磁場S極處理組(CS)，實(shí)驗(yàn)組和對照組的基質(zhì)均為土壤，兩組鱉卵位置的磁感應(yīng)強(qiáng)度(高斯儀，SJL-1，南京山特儀器有限公司)平均為1.2 mT，作用時(shí)間為整個孵化期；第3組，蛭石基質(zhì)處理組(Z)與土壤對照組的孵化基質(zhì)分別為蛭石與土壤。

1.3 稚鱉雌雄分別(性別鑒別)方法

于11月份后對孵化后90～110日齡的中華鱉稚鱉采用3種方法進(jìn)行性別鑒別，每個實(shí)驗(yàn)組的樣品數(shù)不低于200個。方法1為第二性征觀察測量法，解剖鏡觀察尾部形態(tài)、泄殖孔的位置來判別，雄性稚鱉尾長、呈錐形，且超出裙邊，泄殖腔孔近尾中部；雌性稚鱉尾寬短，未超出裙邊，末端驟然變細(xì)且呈結(jié)節(jié)狀，泄殖腔孔近尾基部[14]；方法2為第二性征觀察測量法，解剖鏡觀察泄殖腔(泄殖孔)中有無陰莖、陰莖大小和黑斑(陰莖退化痕跡)來判別[13]； 方法3為顯微解剖觀察法，體視鏡觀察性腺形態(tài)與大小、有無輸卵管來判別雌雄[15～17]。然后，依據(jù)上述方法分別的雌雄個體，全部取性腺部分固定或直接包埋，進(jìn)行冰凍切片(Leica CM1950，德國萊卡公司)、蘇木精-伊紅組織染色(H.E stain)，顯微鏡(Nikon E100，日本尼康公司)觀察精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞、輸卵管或輸精管的特征來判別雌雄[15,16,18]，并計(jì)算雌性個體或雄性個體中的辨別正確率(%)。

使用精度為0.02 mm的數(shù)顯游標(biāo)卡尺(Mitutoyo CD-20AX, 日本)測量稚鱉第二性征器官的長度和直徑。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)描述采用平均數(shù)(Mean)或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)。實(shí)驗(yàn)組中孵化率和孵化性比的顯著性分析采用SPSS 22.0進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 中華鱉雄性與雌性稚鱉的第二性征和第一性征特點(diǎn)

剖開泄殖腔后可以明顯地看到雌性稚鱉的陰莖可見、細(xì)小，黑斑凸起(圖Ⅰ-1)。雄性稚鱉的陰莖明顯、粗壯，棒狀，陰莖龜頭深褐色，腹面白色(圖Ⅰ-2)。在粗壯和細(xì)小之間，一部分個體處于過渡大小。

從圖Ⅰ-3、Ⅰ-4可見，稚鱉有左右對稱的生殖腺，位于體后腹腔背面脊柱的兩側(cè)、腎臟(K)內(nèi)側(cè)；腎上腺(A)線狀梭形，黃色。雌性個體的卵巢(O)為梭形，大小與同齡個體的精巢相當(dāng)，表面不平滑，有系膜與腹腔相連；輸卵管(OV)位于腎臟另一側(cè)，白色管線狀，不與卵巢相連，開口于卵巢的前方體腔，沿卵巢外緣下行，后端彎曲通入泄殖腔(圖Ⅰ-3)。雄性個體的精巢(T)為乳白色，中央粗，兩端細(xì)，表面光滑，外形規(guī)則；輸精管不明顯或難以觀察到(圖Ⅰ-4)。

在稚鱉性腺的組織切片中，輸卵管(OV)明顯可見(圖Ⅰ-5)，而輸精管難以觀察到(圖Ⅰ-6)。卵巢中，觀察有卵原細(xì)胞(OO)和早期的初級卵泡(PO)，初級卵泡多集中在皮質(zhì)部分(圖Ⅰ-7)。卵原細(xì)胞直徑大約2～6 μm，周圍沒有濾泡細(xì)胞(FC)；初級卵泡直徑約為 30～60 μm，周圍有少量的濾泡細(xì)胞，沒有空泡出現(xiàn)(圖Ⅰ-9)。精巢中，曲細(xì)精管(ST)開始形成，管腔不明顯，內(nèi)有精原細(xì)胞(SP)(圖Ⅰ-8)；除了結(jié)締組織基質(zhì)和間質(zhì)細(xì)胞(IC)以外，精原細(xì)胞分布散、數(shù)量較多，多集中于髓質(zhì)(圖Ⅰ-10)。

2.2 不同孵化條件下中華鱉的孵化情況

本實(shí)驗(yàn)在夏季室內(nèi)自然條件下進(jìn)行，各實(shí)驗(yàn)組中華鱉孵化期在43～47 d。從表1可見，蛭石基質(zhì)中的中華鱉孵化率顯著高于土壤介質(zhì)(P<0.05)，平均為90.4%，比土壤介質(zhì)組高出8.3個百分點(diǎn)。磁場N級處理與S級處理都極顯著影響中華鱉的孵化率(P<0.01)，分別平均為51.0%與49.8%，比對照組分布降低28.9個百分點(diǎn)和31.7個百分點(diǎn)。

4.仔豬水腫。新生仔豬常因皮下水腫或漿 液過多造成死亡，可能是溶血性大腸桿菌所致或因缺碘、血液中蛋白質(zhì)過低而引起的。

表1 不同孵化條件下中華鱉的孵化率

注：*T檢驗(yàn)差異顯著(P<0.05)；**T檢驗(yàn)差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 不同孵化條件下中華鱉的孵化性比情況

在依據(jù)方法1和方法2判別雌雄進(jìn)行測量的樣品中，雄性稚鱉的尾長在5.04～6.12 mm，泄殖腔孔距離尾基部長度為2.76～4.02 mm，尾端超出裙邊的長度在0.70～1.92 mm；雌性稚鱉的尾長在4.54～5.52 mm，泄殖腔孔距離尾基部長度為2.80～3.50 mm，尾端離裙邊的長度為0.58～1.56 mm。雄性稚鱉的陰莖直徑在0.76～1.10 mm，自基部長度為2.56～3.04 mm，明顯可見合攏的深褐色龜頭(圖2)；雌性稚鱉中可見退化的陰莖殘跡(圖1)，其直徑0.44～0.52 mm，自基部長度為1.50 mm 以下。

從表2可見，采用觀察第二性征為主的方法1、方法2計(jì)算的雌性占比與方法3得到的結(jié)果明顯不同，在高于或低于對照組數(shù)據(jù)上有的方向相反，且沒有規(guī)律。采用解剖觀察第一性征(輸卵管有無)為主的方法3辨別出的雌雄個體，進(jìn)行了冰凍切片后觀察精原細(xì)胞或卵原細(xì)胞的驗(yàn)證，方法3得到的每組雌性占比數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確率為100%。

磁場N極和S極處理可以顯著提高中華鱉孵化的雌性占比(P<0.01)，分別平均為69.5%和68.3%，比對照組提高11.0個百分點(diǎn)和11.5個百分點(diǎn)；磁場N極和S極處理組間沒有顯著性差異(P>0.05)。土壤基質(zhì)中孵化后雌性占比為56.6%，顯著高于蛭石介質(zhì)的48.2%(P<0.05)，提高8.4個百分點(diǎn)。土壤基質(zhì)中雌性占比在56.6%～58.5%，比蛭石介質(zhì)組有雌性占比較高的現(xiàn)象。

表2 不同孵化條件下中華鱉孵化后雌性占比情況

3 分析與討論

3.1 中華鱉稚鱉的雌雄判別方法比較

一般把夏秋季已出殼到第二年越冬后的中華鱉，稱為稚鱉；稚鱉的雌雄鑒定在性別分化研究中有關(guān)鍵地位，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果和效果的分析和判斷。已有一些研究從外部形態(tài)學(xué)和第二性征解剖觀察來判定中華鱉雌雄，如朱道玉[14]從尾部形態(tài)和泄殖孔位置，李慧君[17]和唐瑤[13]從外生殖器的明顯與退化形態(tài)還有唐瑤[13]從殼長、殼寬、尾長、裙邊寬等數(shù)量特征的統(tǒng)計(jì)分析。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，中華鱉稚鱉第二性征的數(shù)量差異在毫米級別，測量范圍間的基點(diǎn)難以分辨，達(dá)到測量基點(diǎn)固定和清晰的程度，受實(shí)驗(yàn)觀察者主觀影響。所以，用上述方法來分辨稚鱉雌雄的結(jié)果很難做到準(zhǔn)確和有效，依此做出的結(jié)論可靠性也不高。

對通過輸卵管的存在與否，計(jì)數(shù)雌雄個體的結(jié)果是準(zhǔn)確的，并進(jìn)行組織切片驗(yàn)證。孵化出殼后到180日齡稚鱉，卵巢類卵泡已經(jīng)發(fā)育到初級卵泡期，曲細(xì)精管開始形成但不明晰[20]。所以說，解剖后體視顯微鏡或肉眼觀察，依據(jù)腎臟旁白色細(xì)線狀輸卵管的存在與否和與精巢相連的輸精管并不明顯或不可見，可以正確判別稚鱉雌雄。這個結(jié)論與朱道玉[19]、葉玉珍等[20]、余文萍[11]的研究結(jié)果相一致。

3.2 孵化基質(zhì)對中華鱉孵化率和孵化性比的影響

在中華鱉胚胎雄性化誘導(dǎo)方面，使用溫度、激素、其他化學(xué)物進(jìn)行處理可以實(shí)現(xiàn)[10～12]，但有關(guān)雌性化誘導(dǎo)的方法和措施鮮有報(bào)道。已有研究認(rèn)為，通過溫度影響睪酮芳香化酶和睪酮5α-還原酶的活性控制雌、雄激素轉(zhuǎn)化，進(jìn)而決定了個體的性別分化[9,12]；Sf1、Wt1、Sox9、Dmrt1、Dax1等基因參與了龜鱉類性別分化[23]。本實(shí)驗(yàn)中，土壤基質(zhì)中孵化后中華鱉雌性比率達(dá)到56.6%，顯著高于蛭石介質(zhì)中的48.2%。由于孵化基質(zhì)影響中華鱉或龜鱉類動物的雌雄性比或性別分化研究極少，所以其生理生化或分子機(jī)理也無從推測，有待更多、更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

3.3 磁場對中華鱉孵化率與孵化性比的影響

磁技術(shù)具有無污染、無殘毒、效果好、低成本的特點(diǎn)，是一種無公害處理新技術(shù)；磁場分為靜磁場(穩(wěn)恒磁場)和動磁場(變化磁場)，實(shí)驗(yàn)所用鐵氧磁鐵為非均勻性非電流靜磁場類型之一。目前，生物磁學(xué)的研究工作主要集中在植物種子萌發(fā)與生根、微生物代謝、腫瘤細(xì)胞抑制、動物細(xì)胞粘附、細(xì)胞周期變化、細(xì)胞骨架變化等[24,25]；磁場生物作用機(jī)制的探討是一個復(fù)雜而艱難的過程，推測認(rèn)為與胞內(nèi)鈣離子信號通路或其他細(xì)胞膜受體蛋白帶電分子有關(guān)[26]，與磁場中帶電元素運(yùn)動受到的洛倫茲力有關(guān)[24]，與酶結(jié)構(gòu)中金屬原子的順磁性、酶蛋白的半導(dǎo)體性、酶分子構(gòu)象及電荷傳遞變化有關(guān)[27,28]。

有關(guān)水產(chǎn)動物的磁場效應(yīng)實(shí)驗(yàn)有一些報(bào)道。磁感應(yīng)強(qiáng)度(0.07 T)和磁化水(0.05～0.7 T)處理可提高金魚孵化率16%～31%，魚苗生長速度增加30%～40%[29]；養(yǎng)殖奧利亞羅非魚(Tilapiaaureas)可促進(jìn)其生長，并增強(qiáng)其耐寒力[30]；磁場處理(0.2～0.7 T)后磁化水養(yǎng)殖草魚和鯉魚，草魚的紅細(xì)胞、白細(xì)胞、血紅蛋白數(shù)量會有降低，鯉的紅細(xì)胞溶血率會減弱或增強(qiáng)[31]；恒定電磁場(0～2.0 mT)下養(yǎng)殖100 g左右鯽魚，血清中堿性磷酸酶、乙酰膽堿酯酶、溶菌酶的活性和蛋白含量明顯受到抑制或減低，造成不利影響[32]。但是，目前磁場處理對龜鱉孵化效應(yīng)的研究鮮有報(bào)道。

無論是磁場N極處理、還是S極處理，都顯著降低中華鱉的孵化率，平均僅為49.8%～ 50.1%，比對照組降低28.9～31.7個百分點(diǎn)，可以認(rèn)為出現(xiàn)致死現(xiàn)象。雖然本實(shí)驗(yàn)中為弱磁場處理(磁感應(yīng)強(qiáng)度為1.2 mT)，但作用時(shí)間為中華鱉整個孵化期(45 d左右)，孵化過程中長時(shí)間受磁場作用是否會產(chǎn)生不利影響，還有待下一步實(shí)驗(yàn)研究。從孵化后個體雌性占比數(shù)據(jù)來看，磁場處理明顯導(dǎo)致了胚胎雌性化誘導(dǎo)效果，磁場方向(N極、S極)并沒有影響中華鱉的孵化后雌性占比(68.3%～69.5%)，比對照組提高11～11.5個百分點(diǎn)。Vanag 等[27]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1～10 mT的磁場可影響動物細(xì)胞內(nèi)酶的活性，改變其生化反應(yīng)速度。磁場是否促進(jìn)生成雌激素的睪酮芳香化酶的活性，或抑制生成雄激素的睪酮5α-還原酶的活性，是從生理生化水平探討磁場導(dǎo)致中華鱉胚胎雌性化誘導(dǎo)機(jī)制的路徑之一。磁場參數(shù)(類型、方向、強(qiáng)弱、均勻性、作用時(shí)間)和細(xì)胞因子(磁性、種類、敏感性、作用部位)是影響細(xì)胞生物學(xué)磁效應(yīng)的因素[24]，對于磁場誘導(dǎo)中華鱉胚胎雌性化的現(xiàn)象和機(jī)理，還需更多的實(shí)驗(yàn)研究來探討。

圖版Ⅰ：中華鱉雌雄幼鱉的生殖器官形態(tài)與性腺組組學(xué)比較Plate Ⅰ：Comparison of reproductive organs morphology and gonads histology between female and male juvenile soft-shelled turtles,Pelodiscus sinensis圖1、2 中華鱉稚鱉外生殖器(線條指示1 mm);圖3、4 中華鱉稚鱉性腺解剖 (線條指示2 mm) ;圖5、6 中華鱉幼鱉性腺切片觀察(線條指示100 μm) ;圖7、8 中華鱉幼鱉性腺切片觀察(線條指示50 μm);圖9、10 中華鱉幼鱉性腺切片觀察(線條指示20 μm)圖標(biāo)說明：A：腎上腺；FC：濾泡細(xì)胞；FJT：雌性稚鱉生殖器；IC：間質(zhì)細(xì)胞；K：腎臟；MJT：雄性稚鱉生殖器；O：卵巢；OO：卵原細(xì)胞；OV：輸卵管； PO：初級卵泡；SP：精原細(xì)胞；ST：曲精小管；T：精巢。