歐陽杰， 李洪， 王力斌， 李愛輝， 謝書勤， 梁卓虹

東莞東華醫(yī)院腫瘤外科(廣東東莞 523110)

胃癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，目前在國內(nèi)是最高發(fā)的癌癥之一，且胃癌是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。雖然目前胃癌的多種體細胞及相關(guān)機制研究已經(jīng)比較深入，但目前針對胃癌中免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的機制仍需要進一步明確。FOXP3是參與CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)發(fā)育和功能的forkhead家族轉(zhuǎn)錄因子[2]。FOXP3表達被認(rèn)為僅限于T細胞譜系。然而，一些研究人員利用免疫組織化學(xué)和流式細胞術(shù)分析人類黑色素瘤組織，發(fā)現(xiàn)FOXP3不僅在腫瘤浸潤性Treg中表達，而且在黑色素瘤細胞中也表達[3]。因此，F(xiàn)OXP3基因在腫瘤發(fā)生中的功能以及調(diào)節(jié)FOXP3表達的機制目前成為了研究的熱點。研究[4]表明，乳腺癌細胞中FOXP3的表達水平與患者的生存相關(guān)，提示腫瘤FOXP3的表達可能與轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)。但在胃癌中，腫瘤FOXP3的作用及仍需要進一步明確。最近的研究[5]表明腫瘤FOXP3在胃腺癌細胞中的表達抑制細胞增殖并增加細胞凋亡。普遍的細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)抑制因子P21通過作用于G1檢查點，在阻止細胞周期進程中發(fā)揮重要作用[6]。最近的一項研究顯示FOXP3和P21在乳腺癌組織中的表達強烈相關(guān)，特別是在FOXP3誘導(dǎo)后P21上調(diào)并有助于其腫瘤抑制活性[7]。關(guān)于FOXP3和P21之間的在胃癌組織中的關(guān)系仍需要進一步明確。因此，本研究旨在探討胃癌患者組織中FOXP3和P21表達水平的相關(guān)性及與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年7月至2017年1月因胃癌于我院治療的患者86例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理確診為胃癌的患者；(2)病歷資料及病理報告完整；(3)獲得完整隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并免疫系統(tǒng)疾病的患者；(2)不能獲得隨訪及了解預(yù)后情況的患者。本研究經(jīng)向醫(yī)院倫理委員會申請并審核通過。86例胃癌患者，男48例，女38例，年齡34～79歲，平均(49.8±10.7)歲。

1.2 免疫組化檢測 每例患者的組織保存在甲醛溶液，并常規(guī)石蠟包埋，并制成4 μm的切片。在Leica 全自動免疫組化染色儀Bond軟件操作，使用BondDewaxSolution(Vision BioSystems)常規(guī)進行的組織脫蠟，在100℃下采用Bond ER溶劑進行抗原修復(fù)30 min。通過將組織與過氧化氫溫育5 min來淬滅內(nèi)源性過氧化物酶。將切片在室溫下與anti-FOXP3(1 ∶ 100，ab20034, Abcam,UK)，anti-P21(1∶ 200，ab109520; Abcam，UK)按程序室溫孵育1 h，使用不含生物素的聚合物辣根過氧化物酶二抗孵育1 h，細胞核用蘇木精復(fù)染。在顯微鏡下評估FOXP3和P21的表達水平。

1.3 免疫組化統(tǒng)計 在高倍鏡下(200×)評估腫瘤細胞質(zhì)FOXP3的表達水平。至少有20%的核和細胞質(zhì)染色被認(rèn)為是FOXP3表達陽性。P21的表達≥30%的腫瘤細胞則定義為陽性細胞質(zhì)表達。P21和FOXP3在胃癌組織中表達均至少選擇5個視野進行評估，取平均值作為結(jié)果進行計算。

1.4 臨床資料收集 收集所有患者的基本資料，包括腫瘤大小，組織類型、腫瘤TNM分期，病理分期，淋巴結(jié)和血管浸潤情況，記錄患者病理結(jié)果中的P53、Ki67表水平，記錄患者隨訪的生存時間。

2 結(jié)果

2.1 FOXP3表達與臨床特征的關(guān)系 其中胃癌組織中FOXP3表達水平與患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、血管侵襲比例沒有顯著的相關(guān)性(P>0.05)，而TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、病理分期為Ⅰ～Ⅱa期和沒有淋巴侵襲的胃癌患者其FOXP3陽性比例顯著高于陰性表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織中FOXP3表達水平與臨床特征的關(guān)系例(%)

2.2 FOXP3表達與P21及相關(guān)蛋白表達的關(guān)系 胃癌組織中FOXP3表達陽性其P21表達陽性的比例顯著高于P21表達陰性(2=5.217,P=0.022)，且呈顯著的正相關(guān)(r=0.246,P=0.022)，F(xiàn)OXP3表達與P53和Ki67表達無顯著的相關(guān)性(P>0.05)，見表2和圖1。

表2 FOXP3表達與P21及相關(guān)蛋白表達的關(guān)系例(%)

2.3 胃癌組織中FOXP3表達水平與預(yù)后的關(guān)系 其中86例患者其隨訪時間為6～48個月，中位隨訪時間為33個月，總體存活率為69.8%，Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果顯示胃癌組織中FOXP3表達陽性的患者其總體生存率顯著優(yōu)于表達陰性的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(HR=0.429，95CI% 0.197～0.934，P=0.033)，見圖2。

3 討論

目前研究表明FOXP3的表達多被認(rèn)為僅限于T細胞系，而腫瘤細胞中的FOXP3表達本身并不涉及腫瘤發(fā)生[8]。在一些癌癥包括胃癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌和肺癌、腫瘤微環(huán)境中浸潤的FOXP3陽性Tregs增加已被報道為預(yù)后不良的風(fēng)險因素[9-10]。而最近的研究表明腫瘤細胞本身中的FOXP3表達與腫瘤的進展同樣具有密切的聯(lián)系。FOXP3在多種腫瘤細胞中也表達，如乳腺癌細胞、黑色素瘤細胞、胰腺腺癌細胞和各種實體瘤[11]。進一步的研究結(jié)果顯示FOXP3基因是乳腺癌、前列腺癌和非小細胞肺癌的腫瘤抑制基因。FOXP3表達的喪失通過允許HER-2/ErbB2癌基因的增強表達促進腫瘤發(fā)生，從而FOXP3參與HER-2/ErbB2癌基因在乳腺癌進展中的調(diào)節(jié)作用[12]。腫瘤FOXP3的上調(diào)同時可抑制了卵巢癌細胞的增殖，減少細胞的遷移和細胞侵襲[13]。但對于胃癌中FOXP3的表達水平是否與臨床特征具有聯(lián)系仍未明確。

圖1胃癌組織中FOXP3和P21陽性和陰性表達(免疫組化，×200)

圖2 胃癌組織中FOXP3表達與臨床總體生存率的關(guān)系

本研究結(jié)果顯示胃癌組織中癌細胞中也存在FOXP3陽性表達的情況，同時進一步分析胃癌組織FOXP3陽性表達與患者臨床特征的情況，表明了胃癌FOXP3表達與TNM、病理分期和淋巴侵襲密切相關(guān)，同時FOXP3表達與P21的表達呈顯著的正相關(guān)，表明了FOXP3在調(diào)控Treg的功能時，也調(diào)控了腫瘤本身的生長。本研究結(jié)果也與既往研究中FOXP3與P21在人類乳腺癌中的相關(guān)性結(jié)果相似。既往研究[6]顯示了P21作為FOXP3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶點發(fā)揮重要作用，并且其表達介導(dǎo)的乳腺癌細胞系的生長抑制。P21是腫瘤抑制基因的主要下游靶點，由于P21能夠引起G1期細胞周期停滯[14]，因此它是P53信號通路中G1/S轉(zhuǎn)換的重要檢查位點。

最后，本研究也分析了胃癌FOXP3表達與患者預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示了胃癌FOXP3陽性表達的患者其臨床預(yù)后顯著優(yōu)于FOXP3陰性表達的患者，這也進一步確認(rèn)了胃癌中FOXP3的陽性表達是胃癌中的一個抑癌因素。既往關(guān)于腫瘤FOXP3亞細胞定位的研究報道了其在細胞質(zhì)和細胞核中的異源定位[15]。盡管體外證據(jù)表明腫瘤FOXP3的腫瘤抑制功能，一種理論認(rèn)為體外實驗和臨床應(yīng)用之間的這種差異是因為腫瘤FOXP3的差異細胞質(zhì)定位，在癌細胞中發(fā)現(xiàn)的FOXP3的各種亞細胞定位模式可能并不反映特定的功能狀態(tài)[16]。但其如何調(diào)控胃癌病情進展的分子機制仍需要進一步明確。

綜上所述，胃癌組織中FOXP3表達與腫瘤TNM、病理分期和淋巴侵襲密切相關(guān)，F(xiàn)OXP3表達與P21表達呈正相關(guān)，癌組織中FOXP3陽性是胃癌患者良好預(yù)后的重要因素。