謝明智， 李科志, 利基林， 蔡政民， 胡榜利

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究部(廣西南寧 530021)

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，除了手術(shù)治療外，腫瘤靶向治療成為結(jié)直腸癌的重要治療方式，其中抗表皮生長因子受體(EGFR)是目前治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的主要靶向藥物[1]。然而EGFR的治療效果與KRAS和BRAF基因突變密切相關(guān)。KRAS基因野生型患者對于EGFR治療較為敏感，而KRAS基因突變型者治療效果較差[2]。若檢測無KRAS基因突變，還需要檢測BRAF的突變情況，如果BRAF基因發(fā)生突變，則EGFR的療效將顯著降低[3]。因此，明確KRAS和BRAF基因突變情況對于指導(dǎo)結(jié)直腸癌的治療具有重要的臨床意義。本研究回顧性分析我院結(jié)直腸癌患者KRAS和BRAF基因突變及其與臨床病理特征的關(guān)系，以期為患者制定臨床個(gè)體化治療方案提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2015年1月至2017年12月之間的結(jié)直腸癌患者322例的臨床資料，提取患者的性別、年齡、腫瘤原發(fā)部位、分化程度、腫瘤臨床分期、腫瘤浸潤深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及有無腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等。手術(shù)切除標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為腫瘤，獲取新鮮腫瘤組織后，均使用4%甲醛固定石蠟包埋。KRAS基因突變檢測指標(biāo)包括第二外顯子 (G12S、G12D、G12C、G12V、G12A、G12R、G13D)，第四外顯子(K117N、A146T、A146V、A146P)，第三外顯子(Q61H)基因突變，BRAF基因突變檢測指標(biāo)為第十五外顯子(V600E)。

1.2 檢測方法

1.2.1 基因組DNA抽提 采用Qiagen公司(德國)的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Mini Kit)抽提組織DNA，常規(guī)切片4 μm厚5～10張，脫蠟、水化。選取l張HE染色進(jìn)行病理學(xué)評估，其余組織用于提取DNA。首先在顯微鏡下觀察HE切片，選取富于腫瘤細(xì)胞的區(qū)域(腫瘤成分>80%)，標(biāo)記處腫瘤部位，以此張切片為標(biāo)準(zhǔn)，將其他切片對應(yīng)部位的腫瘤組織刮入EP管中，常規(guī)脫蠟處理，用 QIAGEN 公司 QIAAMP DNA FFPE Tissue KIT 提取石蠟切片組織中基因組，對提取的DNA進(jìn)行質(zhì)量控制，質(zhì)控合格的樣品DNA放置-20℃冰箱進(jìn)行保存。

1.2.2 TaqMan探針法 運(yùn)使用人類 KRAS/NRAS/BRAF基因突變聯(lián)合檢測試劑盒(ARMS 法) 進(jìn)行基因突變分析，總反應(yīng)體系均為40 μL，其中包括模板DNA 5 μL，反應(yīng)混合液35 μL；每次反應(yīng)均設(shè)置陽性、陰性對照及外控。所有的反應(yīng)試劑均由此試劑盒提供。反應(yīng)循環(huán)參數(shù): 第一階段:95℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；第二階段:95℃ 25 s，64℃ 20 s，72℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)；第三階段：93℃ 25 s，60℃ 35 s，72℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)；信號收集：第三階段60℃時(shí)收集FAM和HEX(或VIC)信號，執(zhí)行實(shí)時(shí)PCR。反應(yīng)結(jié)束后自動(dòng)調(diào)整基線和閾值即可得到各樣本的突變Ct值，最后根據(jù)說明書判讀KRAS和BRAF基因突變情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 觀察數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較采用2檢驗(yàn)，不滿足2檢驗(yàn)條件的用Fisher精確概率法計(jì)算。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)分析 在322例結(jié)直腸癌患者中，結(jié)腸癌患者182例，直腸癌患者140例，KRAS基因突變105例(32.6%)，BRAF基因突變13例(4.0%)。以結(jié)腸癌和直腸癌為分組進(jìn)行比較，結(jié)果顯示結(jié)腸癌患者和直腸癌患者在性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期的臨床指標(biāo)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但腫瘤浸潤深度方面，結(jié)腸癌患者T3+T4的比例(88.5%)高于直腸癌患者(76.4%)(P=0.004)。結(jié)腸癌和直腸癌患者KRAS和BRAF基因突變情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 KRAS和BRAF基因突變的類型和頻率 在105例KRAS基因突變中，G12D突變40例(38.1%)，G12S突變38例(36.2%)， G12A突變12例(11.4%)，G12V突變9例(8.6%)，G13A突變6例(5.7%)。13例BRAF基因突變型均為V600E型。未發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變合并BRAF基因突變的患者。

2.3 KRAS和BRAF基因突變與臨床病理參數(shù)關(guān)系 根據(jù)KRAS和BRAF基因突變進(jìn)行分組，結(jié)果顯示KRAS基因在不同患者的性別、年齡、腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但與結(jié)腸癌發(fā)生部位存在密切關(guān)系，即右半結(jié)腸癌的KRAS基因突變率(47.2%，34/72)顯著高于左半結(jié)腸癌(27.3%，30/110)和直腸癌(29.3%，41/140)(P=0.010)。

BRAF基因突變方面，BRAF基因突變在不同性別、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、腫瘤部位差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；但發(fā)生BRAF基因突變的患者年齡高于未突變者(P=0.022)，突變患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的比例(60.2%，186/309)比未發(fā)生轉(zhuǎn)移的比例低(92.3%，12/13)(P=0.020)；突變患者Ⅲ+Ⅳ期的比例(65.4%，202/309)低于未突變患者(92.3%，12/13)(P=0.044)。見表2。

表1 結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)分析 例

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)病是一個(gè)在多種因素作用下基因不斷突變導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖的過程。近年來，隨著精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展，結(jié)直腸癌的治療也進(jìn)入了靶向治療的時(shí)代。目前EGFR 基因是臨床上治療結(jié)直腸癌的主要靶點(diǎn)之一，然而該EGFR靶向治療的效果受很多因素的影響，其中KRAS和BRAF基因是否突變與EGFR靶向治療密切相關(guān)[4]。KRAS和BRAF基因野生型患者可從抗EGFR治療中獲益，突變型患者療效很差[2-3]，因此治療靶點(diǎn)的檢測是臨床進(jìn)行個(gè)體化治療的前提。

KRAS基因突變是惡性腫瘤的基因突變的最常見類型之一[5]。KRAS基因突變可見于各種實(shí)體瘤的發(fā)病過程。目前已經(jīng)在60%～90%的胰腺癌，35%的結(jié)腸直腸癌，20%的漿液性卵巢癌和15%的甲狀腺癌中檢測出存在KRAS基因突變[6]。105例KRAS基因突變中G12D突變率為26.25%，G12V突變率為4.17%，G12C突變率為2.50%，G12S突變率為2.08%，G12A突變率為1.67%，G13D突變率為3.33%[7]。結(jié)腸癌患者基因突變率受研究樣本量大小、檢測方法及人種差異的影響而存在不一致的結(jié)果。KRAS基因突變率在30%～43.8%范圍內(nèi)[8-10]，本研究中KRAS基因的突變率為43.1%，結(jié)果與既往的文獻(xiàn)報(bào)道相符。多項(xiàng)研究報(bào)道了KRAS基因突變與結(jié)直腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，但這些結(jié)果存在較大的差異。本研究僅發(fā)現(xiàn)KRAS基因突變與腫瘤部位存在顯著差異，而且右半結(jié)腸癌的突變率最高，這個(gè)結(jié)果也可以部分解釋不同部位的結(jié)腸直腸癌生存率存在明顯差異[11]。

表2 KRAS和BRAF基因突變與臨床病理參數(shù)關(guān)系 例

BRAF基因是KRAS的下游作用因子，與EGFR的治療效果有密切關(guān)系。即使是野生型KRAS的患者，如果發(fā)生BRAF V600E突變，則EGFR藥物(如西妥昔單抗或帕尼單抗)對此類患者的治療效果很差[12]。研究已證實(shí)BRAF基因突變也與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān)，且可以作用腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物之一[13]。國內(nèi)外報(bào)道的結(jié)直腸癌中BRAF基因突變率為4%～13%[14]，本研究中BRAF基因V600E在結(jié)直腸癌中的突變率為4.0%，與文獻(xiàn)報(bào)道的基本相符。在BRAF基因突變與臨床病理參數(shù)關(guān)系方面，我們發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變與患者的年齡、腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期相關(guān)，這個(gè)結(jié)果與KRAS的結(jié)果不一致，表明BRAF基因與KRAS基因的突變是相互獨(dú)立的，各自發(fā)揮作用。然而，我們也注意到，由于BRAF基因的突變頻率較低，且本研究僅為單中心研究，樣本量較小，可能會(huì)導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)結(jié)果存在一定的誤差。

總之，本研究表明，結(jié)直腸癌患者存在較高的KRAS基因突變率，而BRAF基因突變率較低。KRAS基因突變與腫瘤的原發(fā)部位密切相關(guān)，且與BRAF基因突變無直接相關(guān)性，臨床上需要對這兩個(gè)基因進(jìn)行檢測，才能為結(jié)直腸癌的個(gè)體化治療提供更準(zhǔn)確的參考依據(jù)。