楊佩珊，張娟*，劉為佳，朱政明，堵國(guó)成

1(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無(wú)錫，214122) 3(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

乳酸菌可發(fā)酵糖類并產(chǎn)生以乳酸為主的代謝產(chǎn)物，其屬于厭氧或兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性菌[1]，大多數(shù)乳酸菌作為重要的工業(yè)微生物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、精細(xì)化工等領(lǐng)域中[2-4]。乳酸菌在上述應(yīng)用中會(huì)面臨多種環(huán)境脅迫，比如酸、冷凍、滲透壓、氧等[5]，酸脅迫是其中影響乳酸菌存活能力最嚴(yán)重的挑戰(zhàn)之一。乳酸的過量積累使乳酸菌遭受嚴(yán)重的酸脅迫，影響菌株的正常生長(zhǎng)和代謝，從而進(jìn)一步抑制乳酸菌益生功能的發(fā)揮，因此，提高乳酸菌抵抗酸脅迫的能力尤為迫切[6-7]。

目前，提高乳酸菌酸脅迫抗性的策略主要有預(yù)適應(yīng)及交叉保護(hù)[8-9]、適應(yīng)性進(jìn)化[10-11]、外源添加保護(hù)劑[12]和代謝工程改造抗酸元器件[13-14]等。其中抗酸元器件包括一些具有抗酸功能的關(guān)鍵基因、應(yīng)激蛋白和代謝途徑等。酸脅迫條件下，乳酸乳球菌可以通過檸檬酸代謝生成乙偶姻、丁二醇和乙二酰等，這些產(chǎn)物能夠幫助細(xì)胞抵御酸脅迫[15]。氨基酸是維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)代謝的重要原料物質(zhì)之一，其在乳酸菌的生長(zhǎng)代謝和抵抗酸脅迫中，發(fā)揮著重要的作用。外源添加天冬氨酸可有效提高乳酸乳球菌和干酪乳桿菌對(duì)酸脅迫的耐受性[16-17]，張夢(mèng)汝等[18]通過添加亮氨酸提高了乳酸乳球菌在pH 4.0酸脅迫環(huán)境中的存活率，研究表明，酸脅迫條件下乳酸菌可以通過調(diào)節(jié)氨基酸如天冬氨酸和亮氨酸的代謝方式提高細(xì)胞酸耐受性能。目前，關(guān)于乳酸菌中酸脅迫耐受性提升的研究主要集中于氨基酸代謝途徑，而關(guān)于其他類型代謝途徑在幫助乳酸菌細(xì)胞提升酸脅迫耐受性方面的研究相對(duì)較少。嘌呤核苷酸對(duì)能量代謝和各種合成代謝過程如DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成有著至關(guān)重要的作用[19]，調(diào)控嘌呤代謝可在一定程度緩解非生物脅迫的侵?jǐn)_[20]。目前，有關(guān)嘌呤代謝途徑在改善乳酸乳球菌酸脅迫抗性方面的研究還非常有限，僅有的研究發(fā)現(xiàn)，嘌呤代謝中的PurA和GuaB催化轉(zhuǎn)化腺苷和鳥苷一磷酸(AMP和GMP)有利于乳酸乳球菌抵御氧脅迫和酸脅迫[21-22]。

編碼磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀酰胺合酶的purC是IMP生物合成途徑的關(guān)鍵基因，本身也是嘌呤代謝的一部分，該基因能夠催化轉(zhuǎn)化CAIR(羧酰氨基咪唑核糖核苷酸)生成SAICAR(琥珀酰氨基咪唑甲酰胺核苷酸)。研究發(fā)現(xiàn)，purC基因沉默會(huì)引起嘌呤代謝水平改變，產(chǎn)生嘌呤代謝產(chǎn)物的缺陷可導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)延緩[23]。本文通過在L.lactisNZ9000中過表達(dá)嘌呤代謝途徑中的purC基因，考察了重組菌株生長(zhǎng)能力和存活能力，通過檢測(cè)胞內(nèi)ATP和氨基酸含量，研究重組菌株耐受酸脅迫的具體生理響應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及培養(yǎng)條件

大腸桿菌E.coliMC1061，實(shí)驗(yàn)室保藏；乳酸乳球菌L.lactisNZ9000 (保藏編號(hào)：LLN，CP002094；荷蘭“NIZO Food Research”奶制品研究所)；質(zhì)粒pNZ8148，德國(guó)MoBiTec公司；E.coliMC1061在LB培養(yǎng)基(10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、10 g/L NaCl)中37 ℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)；L.lactisNZ9000在GM17培養(yǎng)基(M17培養(yǎng)基中添加5 g/L的葡萄糖)于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.1.2 試劑

蛋白胨、酵母粉和M17肉湯培養(yǎng)基，Oxoid公司；NcoI、HindⅢ快速內(nèi)切酶和GeneJET PCR純化試劑盒，Thermo Scientific公司；Solution I、PrimerSTAR HS (Premix)，大連寶生物工程有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒，生工生物工程(上海)有限公司；nisin，Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒，天根生化科技有限公司；ATP測(cè)定試劑盒，碧云天生物技術(shù)研究所；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械研究所；組織和細(xì)胞勻漿儀，MP Biomedicals公司；M-100生物傳感器分析儀，深圳市西爾曼科技有限公司；Agilent 1260高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國(guó))有限公司；多功能酶標(biāo)儀，Thermo Scientific公司；凝膠成像儀、電轉(zhuǎn)化儀，Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 目的片段的擴(kuò)增及純化

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)公布的磷酸核糖基氨基咪唑-琥珀酰胺合成酶PurC基因序列并利用Primer Primier 5.0設(shè)計(jì)引物purC-F和purC-R(表1)，上、下游引物的5′端分別加入NcoI和HindⅢ兩個(gè)酶切位點(diǎn)(引物中劃線部分)。

表1 用于質(zhì)粒構(gòu)建的引物Table 1 Primers used for plasmid construction

以L.lactisNZ9000的基因組為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得purC基因。PCR反應(yīng)體系：2×Prime STAR HS (Premix) 25 μL，purC-F和purC-R(10 μmol/L)各1 μL，L.lactisNZ9000的基因組模板1 μL，無(wú)菌水22 μL。反應(yīng)條件：95 ℃、3 min；95 ℃、10 s；55 ℃、15 s； 72 ℃、1 min，30個(gè)循環(huán)，使用10 g/L的瓊脂糖凝膠核酸電泳初步確定，并進(jìn)行膠回收獲得目的基因片段。

1.3.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物以及質(zhì)粒pNZ8148采用限制性內(nèi)切酶NcoI和HindⅢ 同時(shí)進(jìn)行雙酶切，并純化回收。將酶切的PCR產(chǎn)物以及pNZ8148使用Solution I連接酶16 ℃ 過夜連接。連接產(chǎn)物通過熱激法轉(zhuǎn)入E.coliMC1061感受態(tài)中，轉(zhuǎn)化后的重組子涂布于含有100 μg/mL 氯霉素的LB固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取氯霉素平板上的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證。將獲得的菌體進(jìn)行培養(yǎng)，提取pNZ8148-purC重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證。通過電轉(zhuǎn)化的方式將測(cè)序成功的重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)入L.lactisNZ9000，并通過菌落PCR驗(yàn)證和10 μg/mL的氯霉素抗性篩選獲得重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)和對(duì)照菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148)。

1.3.3 重組菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定和乳酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

將菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)和L.lactisNZ9000 (pNZ8148)接種于加了10 μg/mL氯霉素的GM17液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，放在30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)過夜。再以2%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至含有氯霉素(10 μg/mL)的GM17液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間取樣，培養(yǎng)至OD600=0.4時(shí)加入10 ng/mL的nisin誘導(dǎo)表達(dá)PurC蛋白，測(cè)定OD600 nm值，使用生物傳感器分析儀測(cè)定各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的葡萄糖質(zhì)量濃度和乳酸產(chǎn)量。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度和乳酸產(chǎn)量為縱坐標(biāo)，繪制重組菌株和對(duì)照菌株的乳酸發(fā)酵曲線。

1.3.4 脅迫條件下重組菌株酸脅迫抗性的分析

在含有10 μg/mL氯霉素的GM17培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組菌株和對(duì)照菌株至OD600約為0.4，加入10 ng/mL的nisin誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，待菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期，離心(8 000 r/min)3 min，使用8.5 g/L生理鹽水等體積洗滌2次、離心、收集菌體，重懸于等體積的GM17培養(yǎng)基中(乳酸調(diào)節(jié)，pH 4.0)。隨后于0、1、2、3、4 h各取900 μL菌液，離心，等體積洗滌并進(jìn)行梯度稀釋，取10 μL合適梯度的重懸液點(diǎn)種于GM17固體平板上，30 ℃下培養(yǎng)24 h，活菌計(jì)數(shù)并計(jì)算存活率[24]。

1.3.5 脅迫條件下重組菌株胞內(nèi)ATP和氨基酸含量的測(cè)定

nisin誘導(dǎo)蛋白表達(dá)后，重組菌株和對(duì)照菌株生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)中后期，離心(8 000 r/min)4 min，使用8.5 g/L 生理鹽水等體積洗滌2次、離心、收集菌體，重懸于等體積的GM17培養(yǎng)基中(pH 4.0)，脅迫一定時(shí)間取樣，收集菌體，破碎細(xì)胞，取細(xì)胞破碎液測(cè)定胞內(nèi)ATP和氨基酸。選用ATP測(cè)定試劑盒測(cè)定胞內(nèi)ATP，高效液相色譜儀測(cè)定胞內(nèi)氨基酸[25]。

1.3.6 蛋白濃度的測(cè)定

蛋白濃度測(cè)定采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，具體按說(shuō)明書操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌株的構(gòu)建

以L.lactisNZ9000基因組為模板，利用引物purC-F和purC-R進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，得到目的PCR產(chǎn)物，核酸電泳結(jié)果顯示，目的基因條帶單一，與理論711 bp大小符合(圖1)。

圖1 目的基因purC的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of gene purC

按照1.3.2的方式構(gòu)建重組質(zhì)粒pNZ8148-purC，結(jié)果如圖2所示。將上述獲得的重組質(zhì)粒導(dǎo)入到E.coliMC1061的感受態(tài)細(xì)胞中，挑取經(jīng)菌落PCR驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆子培養(yǎng)并提取質(zhì)粒，采用NcoI和HindⅢ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，核酸電泳結(jié)果顯示，目標(biāo)條帶在500～750 bp，與已知目的片段大小711 bp相符合，其雙酶切驗(yàn)證結(jié)果如圖3所示。將驗(yàn)證成功的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，并電轉(zhuǎn)入感受態(tài)L.lactisNZ9000，獲得重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)。

圖2 重組質(zhì)粒pNZ8148-purC的構(gòu)建Fig.2 Construction of recombinant plasmid of pNZ8148-purC

圖3 重組質(zhì)粒pNZ8148-purC雙酶切驗(yàn)證Fig.3 Identification of recombinant plasmid pNZ8148-purC by digestion with restriction endonuclease

2.2 重組菌株的生長(zhǎng)曲線和乳酸發(fā)酵性能測(cè)定

為了研究purC基因的過表達(dá)對(duì)L.lactisNZ9000生長(zhǎng)性能的影響，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了對(duì)照菌株和重組菌株在初始pH 7.0條件下的生長(zhǎng)曲線。由圖4可知，重組菌株與對(duì)照菌株生長(zhǎng)狀態(tài)基本一致，說(shuō)明purC的過表達(dá)并未影響L.lactisNZ9000的正常生長(zhǎng)。

圖4 L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)的生長(zhǎng)性能Fig.4 Growth curves of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148)

乳酸菌主要依靠乳酸等有機(jī)酸代謝產(chǎn)物來(lái)發(fā)揮益生功能，提高乳酸菌酸脅迫耐受性的前提應(yīng)是確保其正常的乳酸產(chǎn)量，為了進(jìn)一步考察在初始pH 7.0條件下，重組菌株及對(duì)照菌株的發(fā)酵情況，作者對(duì)菌株的乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗進(jìn)行測(cè)定。由圖5可知，隨著菌株生長(zhǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄糖殘留量逐漸降低，乳酸產(chǎn)量逐漸提高，并且菌株生長(zhǎng)至8 h后葡萄糖與乳酸含量均趨于平緩。重組菌株的乳酸產(chǎn)量和葡萄糖消耗與對(duì)照菌株相比沒有明顯的區(qū)別。說(shuō)明表達(dá)purC基因并未影響重組菌株的正常發(fā)酵生產(chǎn)。

圖5 L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)的葡萄糖和乳酸發(fā)酵曲線Fig.5 The concents of glucose and lactic acid of L. lactisNZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148)

2.3 脅迫條件下重組菌株的存活率測(cè)定

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過量表達(dá)purC基因并未影響重組菌株的正常生長(zhǎng)和發(fā)酵生產(chǎn)。為了進(jìn)一步考察過表達(dá)purC基因?qū)晁崦{迫抗性的影響，對(duì)L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)和L.lactisNZ9000 (pNZ8148)進(jìn)行乳酸脅迫培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，測(cè)定菌株的存活率。L.lactis生長(zhǎng)的最適pH接近中性，隨著其主要代謝產(chǎn)物乳酸產(chǎn)量的積累，胞外pH逐漸下降，最低可降至pH 4.5～5.0[26]，而在pH 4.0的脅迫環(huán)境下，L.lactis的存活率下降最為明顯，因此本實(shí)驗(yàn)選擇pH 4.0作為酸脅迫條件來(lái)研究L.lactis的存活率及相關(guān)生理指標(biāo)[27]。如圖6所示，為培養(yǎng)在GM17(pH 7.0)培養(yǎng)基中的L.lactisNZ9000經(jīng)pH 4.0脅迫后存活率的變化情況。

圖6 脅迫條件下L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)與L. lactis NZ9000 (pNZ8148)的存活率Fig.6 The survival rates of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148) under acid stress

由圖6可知，過量表達(dá)了purC基因的L.lactisNZ9000經(jīng)pH 4.0脅迫處理后的存活率明顯高于未表達(dá)purC基因的L.lactisNZ9000，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，兩者之間存活率的差距變大。經(jīng)pH 4.0脅迫培養(yǎng)3 h后，重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)的存活率是對(duì)照菌株的12.3倍，而在pH 4.0脅迫培養(yǎng)4 h后，重組菌株的存活率是對(duì)照菌株的83.2倍，結(jié)果表明，通過基因工程手段過表達(dá)purC基因能明顯提高L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性(圖6)。

2.4 脅迫條件下重組菌株胞內(nèi)ATP含量的測(cè)定

當(dāng)乳酸菌在酸脅迫環(huán)境的情況下，維持胞內(nèi)pH的平衡最主要的應(yīng)對(duì)方式之一是將胞內(nèi)的H+排出到胞外，此過程是1個(gè)耗能的過程，需要消耗大量ATP來(lái)產(chǎn)生能量。因此實(shí)驗(yàn)考察了酸脅迫條件下菌株胞內(nèi)ATP濃度的變化(圖7)。在pH 4.0脅迫0、1、3 h，胞內(nèi)ATP含量分別為對(duì)照菌株的4.8、6.3和4.3倍，重組菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)與對(duì)照菌株L.lactisNZ9000 (pNZ8148)相比保持了相對(duì)較高的ATP濃度，因此，重組菌株可以釋放更多的ATP，滿足脅迫條件下細(xì)胞對(duì)能量的需求，從而提高細(xì)胞的酸脅迫抗性。

圖7 脅迫條件下L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)胞內(nèi)ATP含量Fig.7 The contents of intracellular ATP pool of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148) under acid stress

2.5 脅迫條件下重組菌株胞內(nèi)氨基酸含量的測(cè)定

氨基酸作為細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分，是多種大分子如蛋白質(zhì)、脂肪酸、核酸等合成的重要原料物質(zhì)之一，其還可以在酶的催化作用下生成與細(xì)胞能量代謝相關(guān)的中間產(chǎn)物[28]。一些氨基酸如天冬氨酸和蘇氨酸可以參與嘌呤合成[29]，在乳酸乳球菌中，嘌呤代謝與氨基酸代謝之間的聯(lián)系如圖8所示，從圖中可以看出，嘌呤代謝途徑可以促進(jìn)ATP的合成，同時(shí)與一些氨基酸的合成如天冬氨酸(aspartate)、谷氨酸(glutamate)、蘇氨酸(threonine)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid)有著密切的聯(lián)系。

為了進(jìn)一步研究過量表達(dá)嘌呤代謝途徑中的purC基因作用效果，測(cè)定了脅迫培養(yǎng)后L.lactisNZ9000 (pNZ8148-purC)的胞內(nèi)氨基酸含量。結(jié)果如圖9所示，酸脅迫前后重組菌株胞內(nèi)天冬氨酸(Asp)、蘇氨酸(Thr)、谷氨酸(Glu)和γ-氨基丁酸(GABA)均高于對(duì)照菌株。

pH 4.0條件下脅迫2 h后重組菌株胞內(nèi)Asp、Thr、Glu和GABA含量分別為對(duì)照菌株的2.1、1.7、1.8和1.4倍。

圖8 L. lactis NZ9000中嘌呤和氨基酸代謝機(jī)制Fig.8 Schematic representation of purine and amino acid pathway in L. lactis NZ9000

Asp在保護(hù)乳酸菌抵御酸脅迫過程中具有重要作用[30]，Asp生成富馬酸(fumarate)的過程中伴隨著NH3的產(chǎn)生，同時(shí)富馬酸能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為蘋果酸，后者可以通過蘋果酸乳酸發(fā)酵途徑消耗胞內(nèi)的H+，減少酸脅迫環(huán)境對(duì)乳酸菌細(xì)胞造成的損傷[31]，進(jìn)而增強(qiáng)L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性[32]。Thr在蘇氨酸脫氨酶的作用下可釋放NH3中和H+[33]。氨基酸脫羧是乳酸菌抵御酸脅迫的一種重要途徑，乳酸菌可以通過脫羧產(chǎn)生CO2，與此同時(shí)消耗H+，從而維持胞內(nèi)pH值的動(dòng)態(tài)平衡。如圖8所示，Glu在谷氨酸脫羧酶催化下脫掉羧基消耗H+，并產(chǎn)生CO2，H+的消耗可提高胞內(nèi)的pH值。同時(shí)，脫羧反應(yīng)生成的GABA作為一種堿性物質(zhì)可被反向轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，進(jìn)一步減輕細(xì)胞的酸脅迫壓力[34]。綜上，作者證實(shí)了在酸脅迫條件下，過量表達(dá)嘌呤代謝途徑中的purC基因，為細(xì)胞提供更多ATP的同時(shí)，重組菌株能夠產(chǎn)生較多的胞內(nèi)天冬氨酸、蘇氨酸、谷氨酸和γ-氨基丁酸，通過生成堿性物質(zhì)和消耗胞內(nèi)質(zhì)子的方式，維持胞內(nèi)pH穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而增強(qiáng)L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性。

A-天冬氨酸含量；B-蘇氨酸含量；C-谷氨酸含量；D-γ-氨基丁酸含量圖9 脅迫條件下L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC)和L. lactis NZ9000 (pNZ8148)胞內(nèi)氨基酸含量Fig.9 The contents of intracellular amino acids of L. lactis NZ9000 (pNZ8148-purC) and L. lactis NZ9000 (pNZ8148) under acid stress

3 結(jié)論

本研究利用NICE系統(tǒng)誘導(dǎo)表達(dá)PurC蛋白提高乳酸菌的酸脅迫抗性，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在酸脅迫條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)的主要是熱休克蛋白以及與DNA修復(fù)相關(guān)的蛋白[35-36]。在乳酸乳球菌(L.lactis)中異源表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌的熱休克蛋白DanK，工程菌對(duì)酸(體積分?jǐn)?shù)0.5%乳酸，pH 5.47)的耐受性顯著提高。WU等[13]通過在L.lactisNZ9000中表達(dá)DNA修復(fù)蛋白R(shí)ecO，重組菌株的存活率是對(duì)照菌株的2.9倍(pH 4.0脅迫5 h)。除此之外，部分外源功能因子在微生物細(xì)胞抵抗酸脅迫中發(fā)揮的作用也有相關(guān)報(bào)道，將L.lactis中海藻糖編碼基因trePP、pgmB及otsB在L.lactisNZ9000中進(jìn)行表達(dá)，重組菌對(duì)酸脅迫(pH 3.0)的耐受性提高了5～10倍[37]。嘌呤核苷酸對(duì)能量代謝和各種合成代謝過程有著至關(guān)重要的作用[19]，嘌呤代謝途徑中的purC基因沉默會(huì)引起嘌呤代謝水平改變，影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[23]。本研究通過在L.lactisNZ9000過量表達(dá)嘌呤代謝途徑中的purC基因，在pH 4.0脅迫4 h后，重組菌株的存活率是對(duì)照菌株的83.2倍，結(jié)果表明，通過基因工程手段過表達(dá)purC基因能明顯提高L.lactisNZ9000的酸脅迫抗性。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，重組菌株可以在酸脅迫條件下維持更高的胞內(nèi)ATP濃度和氨基酸含量，分別通過滿足細(xì)胞對(duì)能量的需求以及生成堿性物質(zhì)和消耗胞內(nèi)質(zhì)子的方式緩解細(xì)胞受到的酸脅迫壓力，從而幫助細(xì)胞抵御酸脅迫。本文首次報(bào)道了在乳酸乳球菌中過量表達(dá)purC基因提高酸脅迫耐受性的作用效果，為進(jìn)一步通過對(duì)嘌呤代謝途徑改造提高細(xì)胞酸脅迫耐受性提供了新的思路。同時(shí)，上述研究結(jié)果也對(duì)關(guān)于purC基因在其他工業(yè)微生物中的應(yīng)用提供了重要的參考。