范聰聰 趙春燕 江海洋 鐵丹丹 趙亞楠 王麗波

吉林大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病原生物學系1(130021) 吉林大學白求恩第一醫(yī)院小兒消化內(nèi)科2

背景：由于臨床上抗菌藥物的不合理使用，幽門螺桿菌(Hp)的耐藥率呈逐年上升的趨勢。不同地區(qū)的Hp耐藥率存在巨大差異。目的：分析長春地區(qū)Hp對七種常用抗菌藥物的耐藥情況，為臨床上選擇抗菌藥物根除Hp感染提供一定的理論指導。方法：收集2014年9月—2017年10月吉林大學白求恩第一醫(yī)院的298例行胃鏡檢查患者的黏膜標本，分離并鑒定Hp，并用瓊脂稀釋法對Hp進行藥敏試驗。結(jié)果：從298例胃黏膜標本中成功分離出69株Hp菌株，陽性率為23.1%。69株菌株中，克拉霉素的耐藥率最高(52.2%)，阿莫西林的耐藥率最低(5.8%)。17株(24.6%)菌株對七種抗菌藥物均敏感，16株(23.2%)菌株對一種抗菌藥物耐藥，36株(52.2%)菌株對兩種及以上抗菌藥物耐藥。結(jié)論：本地區(qū)Hp對克拉霉素、硝唑類藥物均有較高的耐藥性，推薦阿莫西林作為根除Hp感染的藥物。

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori, Hp)是導致慢性胃炎、消化性潰瘍甚至胃癌的主要致病菌[1]。全球約一半人口伴有Hp感染，部分發(fā)展中國家的感染率達80%以上[2-4]。目前，我國Hp感染處理共識報告推薦使用由質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、鉍劑聯(lián)合兩種抗菌藥物組成的含鉍劑四聯(lián)療法對Hp進行根除治療[5]。但由于臨床上抗菌藥物的不合理使用，Hp的耐藥率呈逐年上升的趨勢。Hp耐藥率在不同地區(qū)有巨大的差異，耐藥菌株的產(chǎn)生以及耐藥率的逐年增長為Hp的根除帶來一定困難。因此，推薦根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選擇根除Hp的抗菌藥物，有望提高其根除率。臨床常用的Hp一線抗菌藥物包括阿莫西林、甲硝唑和克拉霉素，二線抗菌藥物包括呋喃唑酮、左氧氟沙星、四環(huán)素和替硝唑。本研究通過測定上述7種抗菌藥物對本地區(qū)分離的69株Hp菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibition concentration, MIC)，旨在初步了解本地區(qū)Hp耐藥狀況并確定敏感抗菌藥物，從而提高Hp根除率。

材料與方法

一、組織來源

選取2014年9月—2017年10月于吉林大學白求恩第一醫(yī)院行胃鏡檢査者(包括慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、胃癌等)的胃部黏膜組織。納入標準：出現(xiàn)上腹部疼痛或有燒灼感，上腹飽脹感并伴有惡心，嘔吐反酸或食欲不振等癥狀。排除標準：①接受過相應(yīng)抗菌藥物治療者；②妊娠期、哺乳期患者；③有嚴重精神疾病不能合作者；④有嚴重肝病、心臟病、惡性腫瘤或呼吸系統(tǒng)疾病者。本研究方案由吉林大學白求恩第一醫(yī)院倫理委員會審批通過，并取得患者的知情同意。

二、主要試劑

哥倫比亞瓊脂和Karmali彎曲桿菌瓊脂(英國OXOID公司)，脫纖維羊血和胎牛血清(南京茂捷微生物科技有限公司)，微需氧產(chǎn)氣袋(日本三菱化學株式會社)，N，N-二甲基甲酰胺、七種抗菌藥物阿莫西林、克拉霉素、左氧氟沙星、呋喃唑酮、甲硝唑、替硝唑、四環(huán)素(北京索萊寶科技有限公司)。

三、方法

1. Hp的分離鑒定：取胃竇部組織2～3塊，充分剪碎研磨后接種于10% Karmali血瓊脂平板上進行分離培養(yǎng)。將培養(yǎng)平板放入?yún)捬豕迌?nèi)，加入適量無菌蒸餾水以及微需氧產(chǎn)氣袋，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4～5 d。將疑似Hp的菌落進行純培養(yǎng)后，給予生物學鑒定(革蘭染色鏡檢、快速尿素酶試驗、氧化酶實驗、觸酶實驗)和分子生物學鑒定(尿素酶A基因和16S rRNA基因鑒定等)，結(jié)果均為陽性的菌株判定為Hp陽性。

2. 制備不同濃度抗菌藥物的哥倫比亞血平板：分別將不同濃度的七種抗菌藥物溶液加入含有15%新鮮血液的哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基中，配成終濃度分別為0.25 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL和128 μg/mL的藥物培養(yǎng)基平板，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

3. 藥敏試驗：用無菌0.9% NaCl溶液將菌株濃度調(diào)整至1.5×108CFU/mL。吸取1～2 μL菌液，分別均勻地接種于上述含不同濃度的七種抗菌藥物的哥倫比亞血平板上，以無抗菌藥物的血瓊脂平板以及質(zhì)控菌株NCTC11637作為陰性對照。全部接種完后將平板倒置于厭氧罐中，加入微需氧產(chǎn)氣袋和適量無菌雙蒸水，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d4后觀察結(jié)果。以不包含細菌的抗菌藥物最高濃度作為MIC。

根據(jù)美國臨床試驗標準委員會(NCCSL)制定的標準，七種抗菌藥物的耐藥臨界值分別為阿莫西林8 μg/mL、甲硝唑8 μg/mL、克拉霉素1 μg/mL、呋喃唑酮2 μg/mL、左氧氟沙星2 μg/mL、替硝唑8 μg/mL、四環(huán)素2 μg/mL。

結(jié) 果

一、Hp菌株的分離培養(yǎng)

在研究期間共收集了298例胃部黏膜組織標本，其中男性165例，女性133例；年齡19～85歲，平均(53.9±10.2)歲。共成功分離出69株Hp菌株，陽性率為23.2%。根據(jù)病理檢查結(jié)果，消化性潰瘍(胃潰瘍和十二指腸潰瘍)分離菌株29株，非潰瘍性消化不良(包括十二指腸炎、非萎縮性胃炎、萎縮性胃炎以及糜爛性胃炎等)分離菌株29株，胃癌分離菌株11株。

二、Hp對七種抗菌藥物的耐藥率

69株菌株中，36株菌株對克拉霉素耐藥，耐藥率為52.2%，明顯高于其他6種抗菌藥物的耐藥率。硝唑類藥物如甲硝唑和替硝唑的耐藥率也相對較高，分別為30.4%和47.8%。阿莫西林的耐藥率最低，為5.8%(表1)。說明阿莫西林可繼續(xù)作為Hp的一線抗菌藥物。

三、七種抗菌藥物的MIC結(jié)果分析

克拉霉素的MIC為0.25～32 μg/mL，多集中于0.25～1 μg/mL；阿莫西林和左氧氟沙星的MIC多集中于0.25～2 μg/mL；甲硝唑、四環(huán)素和呋喃唑酮的MIC多集中于0.25～1 μg/mL；替硝唑的MIC多集中于0.25～32 μg/mL(表2、圖1～2)。

表1 69株Hp菌株對七種抗菌藥物的MIC和耐藥率情況

表2 七種抗菌藥物對69株Hp菌株的MIC分布 (n)

圖1 一線抗菌藥物對69株Hp菌株的MIC分布

圖2 二線抗菌藥物對69株Hp菌株的MIC分布

四、Hp菌株的多重耐藥性

69株Hp菌株中，17株(24.6%)對七種抗菌藥物均敏感；16株(23.2%)對一種抗菌藥物耐藥，其中5株(31.3%)僅對克拉霉素耐藥，6株(37.5%)僅對替硝唑耐藥，2株(12.5%)僅對左氧氟沙星耐藥，2株(12.5%)僅對呋喃唑酮耐藥，1株(6.3%)僅對阿莫西林耐藥，未發(fā)現(xiàn)對四環(huán)素和甲硝唑單獨耐藥的菌株；36株(52.2%)對兩種及以上抗菌藥物耐藥。

討 論

本研究顯示，從吉林長春地區(qū)分離的Hp菌株對克拉霉素的耐藥率為52.2%，明顯高于其他6種抗菌藥物的耐藥率，菌株的MIC為0.25～32 μg/mL，而MIC50為1 μg/mL，故在本地區(qū)應(yīng)用克拉霉素時應(yīng)基于藥敏試驗結(jié)果合理使用。一線抗菌藥物甲硝唑的耐藥率為30.4%，低于全國平均水平67.2%，MIC多集中于0.25～1 μg/mL，說明在對甲硝唑敏感的菌株中，其抑菌活性仍較高。阿莫西林的耐藥率最低，僅為5.8%，菌株的MIC為0.25～2 μg/mL。因此，阿莫西林可繼續(xù)作為根除Hp的一線抗菌藥物。同時本地區(qū)出現(xiàn)了多重耐藥菌株，多重耐藥率占52.2%。多重耐藥菌株的出現(xiàn)導致臨床選擇抗菌藥物存在極大的困難，從而影響Hp的根除效果。

據(jù)報道，北京地區(qū)2008—2014年間克拉霉素的耐藥率已從37%上升至52%，甲硝唑耐藥率保持在68%左右[6]。2010—2013年浙江嘉興地區(qū)甲硝唑耐藥率均為100%，克拉霉素耐藥率已上升至30.9%[7]。Kuo等[8]分析發(fā)現(xiàn)，亞太地區(qū)Hp的耐藥率呈上升趨勢，克拉霉素的平均耐藥率為17%，甲硝唑為44%，左氧氟沙星為18%，阿莫西林和四環(huán)素的耐藥率約為4%。由于抗菌藥物的濫用，我國各地區(qū)Hp耐藥率均已遠超平均水平。Kobayashi等[9]發(fā)現(xiàn)日本克拉霉素的耐藥率從2002年的18.9%升至2005年的27.7%；而甲硝唑耐藥率變化不大，為3.3%～5.3%。一項納入18個歐洲國家2 204 例患者的研究[10]結(jié)果顯示，歐洲地區(qū)Hp對克拉霉素、甲硝唑和左氧氟沙星的耐藥率分別為17.5%、34.9%和14.1%。其中甲硝唑的耐藥率與本研究結(jié)果相當。阿莫西林的耐藥率幾乎可忽略不計。Hp的耐藥性存在較大的區(qū)域差異，因此在選擇抗菌藥物時，應(yīng)針對患者和當?shù)啬退幈O(jiān)測結(jié)果制定有效的抗菌藥物治療策略，可減少抗菌藥物的耐藥性，進而減少治療失敗。

Hp對抗菌藥物耐藥是影響當前根除方案療效的主要因素[11]。不同區(qū)域的細菌耐藥率不同，一般與人群中抗菌藥物的使用習慣密切相關(guān)[12-13]。日本一項研究[14]發(fā)現(xiàn)，在1993—2000年期間，克拉霉素的使用率及其耐藥率增加了四倍。與此相反，在過去的數(shù)十年中，英國、荷蘭、挪威等歐洲國家謹慎使用抗菌藥物，Hp的耐藥率較低，而葡萄牙、匈牙利等國家的克拉霉素耐藥率卻明顯增高[10,15-16]。歐洲Hp處理指南建議，一線治療方案應(yīng)根據(jù)克拉霉素和甲硝唑的耐藥率來調(diào)整，若克拉霉素耐藥率>15%～20%或甲硝唑耐藥率>40%，應(yīng)選擇阿莫西林來根除Hp[17]。因此，檢測Hp對這些常用抗菌藥物的耐藥率對Hp的根除是至關(guān)重要的，以便在臨床實踐中選擇最適合的抗菌藥物。

總之，本研究結(jié)果顯示本地區(qū)Hp對克拉霉素、硝唑類藥物均有較高的耐藥性，推薦阿莫西林作為根除Hp感染的藥物。