耿 麗 王許平 楊貝貝 王丹丹 高 闖 杜曉博 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)中國(guó)炎癥性腸病聯(lián)盟 河南省炎癥性腸病中心(450014)

背景：基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)是MMPs家族中的一員，可表達(dá)于多種器官受損的黏膜上皮細(xì)胞中。多配體蛋白聚糖-1(SDC-1)是MMP-7的作用底物之一，在促進(jìn)組織修復(fù)、維持腸屏障功能等方面發(fā)揮重要作用。目的：探討MMP-7和SDC-1在炎癥性腸病(IBD)中的表達(dá)及其意義。方法：收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年1月—2018年1月住院活動(dòng)期IBD患者的腸組織標(biāo)本45例和外周血標(biāo)本50例，同期非IBD腸組織標(biāo)本30例和外周血標(biāo)本35例作為對(duì)照組。采用免疫組化法檢測(cè)腸組織MMP-7、SDC-1表達(dá)，ELISA法檢測(cè)血清SDC-1含量。結(jié)果：MMP-7在IBD患者的腸組織中呈高表達(dá)，特別是潰瘍邊緣的腸上皮細(xì)胞。與對(duì)照組相比，IBD患者腸組織MMP-7表達(dá)增高、SDC-1表達(dá)降低，血清SDC-1含量增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，腸組織MMP-7表達(dá)與IBD疾病活動(dòng)度呈顯著正相關(guān)(潰瘍性結(jié)腸炎：rs=0.519, P<0.05；克羅恩?。簉s=0.583, P<0.05)，與腸組織SDC-1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.646, P<0.05)。結(jié)論：MMP-7在IBD患者腸組織中表達(dá)增高，通過(guò)剪切SDC-1影響受損腸組織修復(fù)，參與IBD的發(fā)生、發(fā)展。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一組病因不明、反復(fù)發(fā)作的慢性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，目前認(rèn)為其發(fā)生主要與遺傳易感性、腸道內(nèi)環(huán)境以及宿主不恰當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答有關(guān)。

基質(zhì)金屬蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)又稱基質(zhì)溶解素(matrilysin)，是MMPs家族中相對(duì)分子質(zhì)量最小的一員。MMPs是一類普遍表達(dá)的鋅依賴性內(nèi)肽酶，底物特異性廣泛，除剪切細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的蛋白質(zhì)和蛋白多糖組分外，MMPs還可剪切多種非基質(zhì)底物，包括細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞表面黏附受體[1]。生理情況下，ECM組分的合成和降解處于平衡狀態(tài)，病理狀態(tài)下，這一平衡被打破，可能導(dǎo)致潰瘍和纖維化發(fā)生[2]。多配體蛋白聚糖-1(syndecan-1, SDC-1)屬于Ⅰ型跨膜蛋白，是MMP-7的作用底物之一，在促進(jìn)組織修復(fù)、維持腸屏障功能等方面發(fā)揮重要作用[3-4]。本研究通過(guò)檢測(cè)MMP-7、SDC-1在活動(dòng)期IBD患者腸道和外周血中的表達(dá)，旨在探索兩者在IBD發(fā)生、發(fā)展中的作用及其臨床意義。

材料與方法

一、標(biāo)本來(lái)源

收集鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院2017年1月—2018年1月住院IBD患者的腸組織標(biāo)本45例(取自病變最明顯處)和外周血標(biāo)本50例。入組病例診斷符合2018年《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)》[5]，UC和CD疾病活動(dòng)性的評(píng)估分別采用改良Mayo評(píng)分和簡(jiǎn)化CD活動(dòng)指數(shù)(CDAI)，所有病例病情均處于活動(dòng)期。收集同期結(jié)腸癌術(shù)后腸組織標(biāo)本30例(切緣大體和光學(xué)顯微鏡下均未見(jiàn)癌組織的正常結(jié)腸、回腸組織)，以及健康體檢者和健康志愿者外周血標(biāo)本35例作為對(duì)照組。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，研究對(duì)象對(duì)標(biāo)本采集均知情同意。

二、主要試劑

兔抗人MMP-7多克隆抗體、兔抗人SDC-1多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔二抗、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；人SDC-1 ELISA試劑盒(武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司)。

三、方法

1. 免疫組化法檢測(cè)腸組織MMP-7、SDC-1表達(dá)：腸組織標(biāo)本4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，2 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟、水化，枸櫞酸鹽緩沖液抗原修復(fù)，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，山羊血清室溫封閉30 min，加入MMP-7抗體(工作濃度1∶600)或SDC-1抗體(工作濃度1∶800)，4 ℃孵育過(guò)夜，反應(yīng)增強(qiáng)液室溫孵育20 min，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育20 min，DAB顯色，1%鹽酸乙醇分化，蘇木精復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。

結(jié)果判定：光學(xué)顯微鏡下見(jiàn)胞質(zhì)/胞膜染色為陽(yáng)性細(xì)胞。在雙盲條件下，由2名醫(yī)師在200倍視野下隨機(jī)選取5個(gè)清晰無(wú)折疊的視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取均值，并觀察染色強(qiáng)度。陽(yáng)性細(xì)胞率：≤5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強(qiáng)度：無(wú)染色，0分；淺黃色，1分；黃色，2分；棕黃色，3分。免疫組化評(píng)分為兩項(xiàng)評(píng)分的乘積：0分，陰性(-)；1～4分，弱陽(yáng)性(+)；5～8分，陽(yáng)性(++)；9～12分，強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

2. ELISA法檢測(cè)血清SDC-1含量：外周血標(biāo)本離心分離血清，-80 ℃保存。設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔和待測(cè)樣品孔，分別加樣，37 ℃溫育1 h，加入生物素化SDC-1抗體，37 ℃溫育1 h，洗滌，加入HRP標(biāo)記的鏈霉親和素，37 ℃溫育30 min，洗滌，顯色后終止反應(yīng)。于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔吸光度值(A值)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣品濃度。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、一般情況

45例IBD腸組織標(biāo)本中，UC 27例，CD 18例；50例IBD外周血標(biāo)本中，UC 28例，CD 22例。病例組性別構(gòu)成和年齡與相應(yīng)對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 采集腸組織和外周血標(biāo)本IBD患者的一般情況

二、腸組織MMP-7表達(dá)

免疫組化染色顯示，對(duì)照組腸組織中可見(jiàn)極少量MMP-7陽(yáng)性細(xì)胞，染色強(qiáng)度較弱；UC組和CD組腸組織中可見(jiàn)大量胞質(zhì)黃色或棕黃色染色的MMP-7陽(yáng)性細(xì)胞，主要為腸上皮細(xì)胞，特別是潰瘍邊緣的腸上皮細(xì)胞，同時(shí)黏膜下層浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中亦有MMP-7表達(dá)(圖1)。UC組和CD組MMP-7免疫組化評(píng)分均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(8.17±1.17、8.67±1.97對(duì)0.33±0.52,P<0.05)，UC組與CD組間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，在IBD患者中，腸組織MMP-7表達(dá)與UC和CD疾病活動(dòng)度均呈顯著正相關(guān)(UC:rs=0.519,P<0.05; CD:rs=0.583,P<0.05)。

三、腸組織SDC-1表達(dá)

免疫組化染色顯示，對(duì)照組腸組織中可見(jiàn)較多黃色或棕黃色染色的SDC-1陽(yáng)性細(xì)胞，染色強(qiáng)度較強(qiáng)，多分布于腸上皮細(xì)胞的基底外側(cè)膜；UC組和CD組腸組織中SDC-1陽(yáng)性細(xì)胞較少，染色強(qiáng)度較弱，呈淺黃色(圖1)。UC組和CD組SDC-1免疫組化評(píng)分均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.17±0.98、1.83±0.41對(duì)6.50±1.76,P<0.05)，UC組與CD組間差異則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，IBD患者腸組織中的MMP-7表達(dá)與SDC-1表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.646,P<0.05)。

四、血清SDC-1含量

IBD腸組織中MMP-7的剪切作用使SDC-1胞外域脫落增加，可致外周血游離SDC-1含量增高。本研究進(jìn)一步以ELISA法檢測(cè)各組血清SDC-1含量，結(jié)果顯示UC組和CD組血清SDC-1含量均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(34.24±10.24) ng/mL、(35.78±19.51) ng/mL對(duì)(19.44±3.69) ng/mL,P<0.05]，CD組略高于UC組，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Spearman相關(guān)系數(shù)分析顯示，IBD患者腸組織中的SDC-1表達(dá)與血清SDC-1含量呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.667,P<0.05)。

討 論

IBD是一組以腹痛、腹瀉、黏液膿血便為臨床特征的慢性腸道炎癥性疾病，病因和發(fā)病機(jī)制不明，病情反復(fù)發(fā)作，近年來(lái)其發(fā)病率在我國(guó)乃至全球均呈上升趨勢(shì)[6]。MMP-7為MMPs家族中的一員，可表達(dá)于多種器官受損的黏膜上皮細(xì)胞中，如胃腸道、肺、腎臟、角膜等[7-10]，參與損傷組織的上皮修復(fù)和再生以及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，但其在IBD中的作用尚未完全明確。有研究[11]發(fā)現(xiàn)，在UC腸組織中，MMP-7主要表達(dá)于潰瘍邊緣上皮細(xì)胞，且其表達(dá)與炎癥程度相關(guān)。另一項(xiàng)研究[12]顯示，MMP-7在UC腺上皮中的表達(dá)與糜爛發(fā)生呈正相關(guān)；在CD腸組織中，MMP-7在炎性浸潤(rùn)部位呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。Puthenedam等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，MMP-7可剪切半乳糖凝集素-3，使其活性降低，進(jìn)而影響IBD腸道損傷的修復(fù)。另有研究[14]表明，野生型急性結(jié)腸損傷小鼠的死亡率顯著高于MMP-7-/-結(jié)腸損傷小鼠，前者腸道損傷的修復(fù)(包括上皮細(xì)胞增殖、隱窩結(jié)構(gòu)重建)雖快于后者，但中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)深度和范圍亦更大，導(dǎo)致?lián)p傷加重。上述結(jié)果提示了MMP-7在腸道損傷修復(fù)過(guò)程中的雙重作用，組織受損時(shí)其表達(dá)增加，一定量的MMP-7為損傷修復(fù)所必需，表達(dá)過(guò)量則不利于損傷修復(fù)，甚至?xí)又啬c道損傷。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)IBD患者腸組織中的MMP-7表達(dá)較正常腸組織顯著增強(qiáng)，并與疾病活動(dòng)度呈顯著正相關(guān)，與既往研究結(jié)果一致，提示在IBD中，MMP-7過(guò)表達(dá)不利于腸黏膜上皮修復(fù)，甚至可能誘發(fā)潰瘍。MMP-7是IBD潛在的治療靶點(diǎn)，應(yīng)用其抑制劑或可減緩IBD疾病進(jìn)程。

SDC-1又稱CD138，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成員之一，生理情況下表達(dá)于多種細(xì)胞的細(xì)胞膜，主要由保守的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和含硫酸乙酰肝素糖胺聚糖鏈的胞外結(jié)構(gòu)域組成。SDC-1在促進(jìn)組織修復(fù)、調(diào)節(jié)免疫功能等方面發(fā)揮重要作用，同時(shí)還可調(diào)節(jié)緊密連接的組成并維持黏膜屏障功能[3-4]。Floer等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，SDC-1對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎具有保護(hù)作用。IBD時(shí)大量分泌的促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)可下調(diào)腸上皮細(xì)胞表面的SDC-1表達(dá)，其表達(dá)下調(diào)歸因于蛋白胞外域的脫落，因此IBD患者外周血可溶性SDC-1含量顯著增加[16-17]。SDC-1是MMP-7的作用底物之一[18]，IBD患者腸組織中過(guò)表達(dá)的MMP-7剪切SDC-1，使其胞外域脫落并失去活性，進(jìn)而使SDC-1促進(jìn)受損腸組織修復(fù)的功能降低。本研究發(fā)現(xiàn)IBD患者腸組織中SDC-1表達(dá)減弱，并與MMP-7表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，為理解IBD患者腸組織損傷修復(fù)延緩、MMP-7表達(dá)增強(qiáng)、SDC-1功能下降的現(xiàn)象提供了依據(jù)。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)IBD患者血清SDC-1含量明顯增高，與腸組織中MMP-7剪切SDC-1增加相一致，提示IBD患者的血清游離SDC-1可在一定程度上反映其在腸組織中的丟失情況。

圖1 MMP-7、SDC-1在IBD患者腸組織中的表達(dá)(免疫組化染色，×200)

綜上所述，本研究主要發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期IBD患者腸組織中MMP-7表達(dá)增高，并與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，提示其可能參與了IBD的發(fā)生、發(fā)展，在疾病活動(dòng)度評(píng)估以及作為IBD的治療靶點(diǎn)方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。腸組織中的MMP-7通過(guò)剪切SDC-1影響受損腸組織修復(fù)，進(jìn)而引起血清游離SDC-1含量增加，后者可能作為區(qū)分IBD與非IBD以及評(píng)價(jià)IBD藥物療效的生物學(xué)標(biāo)記物。本實(shí)驗(yàn)為單中心觀察性研究，研究樣本量較小，未來(lái)擬開(kāi)展多中心研究以及更深入的基礎(chǔ)研究，進(jìn)一步闡明MMP-7在IBD中的作用機(jī)制。