任建峰 張其勝 王 慧 陸穎影 靖大道#

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院消化科1(200080) 上海市第四人民醫(yī)院消化科2

背景：解沒(méi)食子酸鏈球菌(SG)可能通過(guò)其代謝產(chǎn)物改變結(jié)腸微環(huán)境，使人體轉(zhuǎn)變?yōu)閮A向腫瘤形成的高危狀態(tài)。目的：探討SG代謝產(chǎn)物(SGM)對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控作用及其機(jī)制。方法：常規(guī)培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620，并分為空白組(A組)、健康人腸道菌群組(B組)、雙歧桿菌代謝產(chǎn)物組(C組)、SGM組(D組)和雙歧桿菌代謝產(chǎn)物+SGM組(E組)。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)，實(shí)時(shí)PCR法檢測(cè)c-myc mRNA表達(dá)。結(jié)果：與A組、B組、C組相比，D組、E組細(xì)胞增殖活力顯著升高(P<0.05)，細(xì)胞遷移能力顯著升高(P<0.05)，β-catenin蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，c-myc mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)；而D組與E組上述指標(biāo)相比無(wú)明顯差異(P>0.05)。結(jié)論：SG可通過(guò)其代謝產(chǎn)物增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移能力，該作用可能是通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的。而聯(lián)合雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能抑制SGM對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和遷移的促進(jìn)作用。

結(jié)直腸癌是人類(lèi)第三大癌癥，也是導(dǎo)致癌癥相關(guān)死亡的第四大常見(jiàn)原因[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)病是一個(gè)多因素、多步驟、多途徑的過(guò)程，涉及進(jìn)行性分子遺傳學(xué)改變和相關(guān)的組織形態(tài)學(xué)改變。其發(fā)生、發(fā)展的原因尚不清楚，可能是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果[2]。人類(lèi)腸道環(huán)境復(fù)雜，細(xì)菌、真菌與病毒共存，數(shù)量高達(dá)100萬(wàn)億，是人類(lèi)細(xì)胞的10倍。生理情況下，腸道細(xì)菌參與人體多種基本生理活動(dòng)，如促進(jìn)腸道發(fā)育成熟、調(diào)節(jié)人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收、抵抗病原體的入侵等[3]。腸道菌群的穩(wěn)態(tài)一旦被破壞，可導(dǎo)致種疾病，甚至某些腸道菌群可能通過(guò)信號(hào)通路機(jī)制參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。

近年來(lái)，已有越來(lái)越多的研究結(jié)果證實(shí)牛鏈球菌(Streptococcusbovis)感染與結(jié)直腸癌的發(fā)生有關(guān)[4-6]，其在腫瘤微環(huán)境中具有增殖優(yōu)勢(shì)，而在健康腸道中的感染能力較弱，但具體的致癌機(jī)制目前尚未完全清楚。解沒(méi)食子酸鏈球菌(Streptococcusgallolyticus, SG)屬牛鏈球菌，與其他種類(lèi)相比，SG更有可能參與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[7]。本研究通過(guò)觀察解沒(méi)食子酸鏈球菌代謝產(chǎn)物(Streptococcusgallolyticusmetabolites, SGM)對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620生長(zhǎng)、遷移的影響，旨在探討其與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系及其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

一、主要材料與儀器

SG由上海生物科學(xué)研究院惠贈(zèng)，從樹(shù)袋熊的排泄物中分離，由Micro Scan Auto SCAN4微生物分析儀鑒定結(jié)果為SG(概率：99%)；雙歧桿菌(CICC-6071)購(gòu)于北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司，置于BHI培養(yǎng)基中培養(yǎng)。人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620購(gòu)自上海信裕生物科技有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)生物昌盛技術(shù)有限責(zé)任公司；β-actin抗體(工作濃度為1∶500)、β-catenin抗體 (工作濃度為1∶1 000)、IgG二抗(工作濃度為1∶500)購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

Step One Plus熒光實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(Applied Biosystems)； VM-10 WiseMix VM 渦旋振蕩器；SDS-PAGE電泳儀、Universal hood Ⅱ化學(xué)發(fā)光成像儀(Bio-Rad)。

二、方法

1. 細(xì)菌培養(yǎng)和代謝產(chǎn)物提取

①健康人腸道菌群的分離培養(yǎng)：將1 g健康志愿者(否認(rèn)家族性遺傳疾病史，完善內(nèi)鏡、生化等各項(xiàng)檢查，結(jié)果均正常)糞便接種至庖肉培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3～5 d。無(wú)菌紗布過(guò)濾， 14 000 r/min離心15 min，去上清。稱(chēng)取1 g細(xì)菌備用，剩余細(xì)菌以無(wú)菌純甘油重懸后-80 ℃保存待測(cè)。

②細(xì)菌代謝產(chǎn)物的提?。簩? g細(xì)菌接種于200 mL DMEM/F12培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)3 d；14 000 r/min 離心15 min，取上清，-80 ℃保存待測(cè)。

2. 細(xì)胞培養(yǎng)和分組：人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW620常規(guī)傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，并分為空白組(A組)、健康人腸道菌群組(B組)、雙歧桿菌代謝產(chǎn)物組(C組)、SGM組(D組)和雙歧桿菌代謝產(chǎn)物+SGM組(E組)，A組僅加入培養(yǎng)基，B、C、D組分別按體積比加入相應(yīng)的5%細(xì)菌代謝產(chǎn)物，E組加入各5%的雙歧桿菌代謝產(chǎn)物和SGM。

3. 結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的檢測(cè)：取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞1×105個(gè)/mL，接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔100 μL，每組設(shè)15復(fù)孔。37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h，上酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

4. 結(jié)腸癌細(xì)胞遷移的檢測(cè)：在6孔板背后均勻劃?rùn)M線，間隔0.5 cm，每孔至少穿過(guò)5條線。取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞5×106個(gè)/mL，制備成細(xì)胞懸液，接種于6孔板上，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h。PBS洗3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基，37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)24 h后取樣，拍照，觀察細(xì)胞遷移情況。

5. 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)：取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，Lowry法測(cè)定蛋白濃度。取總蛋白40 μg上樣，30～50 mA恒流進(jìn)行電泳跑膠。使用濕轉(zhuǎn)法將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，100 V恒壓90 min后轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，洗滌，加入β-catenin抗體、β-actin抗體4 ℃孵育過(guò)夜；PBST洗膜5 min×3次，加入IgG二抗室溫孵育約1 h，PBST洗膜5 min×3次。ECL法顯色。計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

6. 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)c-myc mRNA表達(dá)：行預(yù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)引物擴(kuò)增的Ct值和融解曲線。取各組細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，行PCR反應(yīng)。c-myc引物上游：5’-TCA GAG AAG CTG GCC TCC TA-3’，下游：5’-TCC AGC AGA AGG TGA TCC AGA-3；以β-actin作為內(nèi)參，引物上游：5’-TTC GAG CAG GAA TCT GAC ACA T-3’，下游：5’-CAA TGA TGG CTG GAA GAG GAC-3’。PCR反應(yīng)體積共20 μL，內(nèi)含SYBR?Green Realtime PCR Master Mix(2x)10 μL、10 μmol/L上、下游引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、RNase Free ddH2O 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)；60～95 ℃緩慢升溫，融解曲線信號(hào)檢測(cè)30 min。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、細(xì)胞增殖情況

CCK-8法顯示，培養(yǎng)48 h、72 h后，D組細(xì)胞增殖活力均顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，說(shuō)明SGM具有更強(qiáng)的促進(jìn)SW620細(xì)胞增殖的能力。E組細(xì)胞增殖活力均顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，而B(niǎo)組、C組細(xì)胞增殖活力與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)，D組與E組相比亦無(wú)明顯差異(圖1、表1)。提示聯(lián)合雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能降低或抑制SGM的促細(xì)胞增殖能力。

二、細(xì)胞遷移情況

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，SW620細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，D組細(xì)胞遷移距離顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，提示SGM具有更強(qiáng)的促進(jìn)SW620細(xì)胞遷移的能力。同時(shí)，E組細(xì)胞遷移距離顯著高于A組、B組、C組(P<0.05)，而B(niǎo)組、C組細(xì)胞遷移距離與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；D組與E組之間細(xì)胞遷移距離相比亦無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖2、表2)。提示聯(lián)合雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能降低或抑制SGM促進(jìn)SW620細(xì)胞遷移的能力。

三、β-catenin蛋白表達(dá)情況

蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，D組β-catenin蛋白表達(dá)顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)， 提示SGM可能通過(guò)激活Wnt信號(hào)通路，進(jìn)一步調(diào)控下游腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí)，E組β-catenin蛋白表達(dá)顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，而B(niǎo)組、C組β-catenin蛋白表達(dá)與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；D組與E組之間β-catenin蛋白表達(dá)亦無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖3、表2)。提示聯(lián)合雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能降低或抑制SGM激活Wnt信號(hào)通路的能力。

圖1 不同代謝產(chǎn)物對(duì)SW620細(xì)胞增殖活力的影響

組別24 h48 h72 hA組0.14±0.060.25±0.020.51±0.17B組0.10±0.020.27±0.070.65±0.28C組0.12±0.030.30±0.070.59±0.27D組0.26±0.080.76±0.17?1.25±0.10?E組0.28±0.100.74±0.10?1.19±0.05?

*與相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)的A、B、C組比較，P<0.05

圖2 不同代謝產(chǎn)物對(duì)SW620細(xì)胞遷移能力的影響(細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn))

組別遷移距離(μm)β-catenin蛋白c-myc mRNAA組9.93±8.210.42±0.121.84±0.12B組15.92±5.270.47±0.091.87±0.10C組14.96±6.240.53±0.171.92±0.07D組31.78±4.04?1.47±0.14?6.21±0.24?E組32.64±2.90?1.30±0.11?6.09±0.33?

*與A、B、C組比較，P<0.05

四、c-myc mRNA表達(dá)情況

定量PCR法結(jié)果顯示，D組c-myc mRNA表達(dá)顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，提示SGM可促進(jìn)Wnt信號(hào)通路下游腫瘤相關(guān)靶基因c-myc mRNA表達(dá)。同時(shí)，E組c-myc mRNA表達(dá)亦顯著高于A組、B組和C組(P<0.05)，而B(niǎo)組、C組c-myc mRNA表達(dá)與A組相比無(wú)明顯差異(P>0.05)；D組與E組之間c-myc mRNA表達(dá)水平亦無(wú)明顯差異(P>0.05)(圖4、表2)。提示聯(lián)合雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能降低或抑制SGM促進(jìn)c-myc mRNA表達(dá)的能力。

圖3 不同細(xì)菌代謝產(chǎn)物對(duì)SW620細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)的影響(蛋白質(zhì)印跡法)

圖4 各組SW620細(xì)胞中c-myc mRNA表達(dá)情況(定量PCR法)

討 論

腸道微生態(tài)與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，腸道菌群在生理?xiàng)l件下一般保持動(dòng)態(tài)平衡，一旦該平衡被打破，可能會(huì)引起各種腸道疾病的發(fā)生、發(fā)展。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物作為環(huán)境因子，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，在結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用[8]，可直接或間接促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展[9]。牛鏈球菌是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)與結(jié)腸癌發(fā)生相關(guān)的細(xì)菌，McCoy等于1951年報(bào)道了第一例與牛鏈球菌感染性心內(nèi)膜炎相關(guān)的結(jié)直腸癌[10]。牛鏈球菌包括許多亞種，其中SG與結(jié)直腸癌的相關(guān)性最強(qiáng)，相關(guān)研究顯示，SG感染患者結(jié)直腸癌、腺瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高，是引起結(jié)腸癌的主要細(xì)菌之一[11-16]。

SG感染患者的結(jié)腸直腸癌和腺瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著升高，提示SG在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮積極作用，但其作用機(jī)制目前尚不清楚。Kumar等[17]將SG與不同細(xì)胞株共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)SG可能通過(guò)β-catenin對(duì)一些結(jié)腸癌細(xì)胞起促進(jìn)生長(zhǎng)和增殖的能力，且SG可促進(jìn)小鼠結(jié)直腸癌模型腫瘤的生長(zhǎng)。該研究認(rèn)為SG感染促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的方式取決于細(xì)胞環(huán)境、細(xì)菌生長(zhǎng)階段和細(xì)菌與結(jié)腸癌細(xì)胞之間的直接接觸。本研究應(yīng)用SGM處理人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞增殖能力顯著高于空白組、健康人腸道菌群和雙歧桿菌代謝產(chǎn)物組，提示SG可通過(guò)其代謝產(chǎn)物促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖，而無(wú)需與細(xì)胞直接接觸。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SGM組細(xì)胞增殖與雙歧桿菌代謝產(chǎn)物+SGM組相比無(wú)明顯差異，提示SGM促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用并未被雙歧桿菌代謝產(chǎn)物所抑制。

腸道微生物構(gòu)成的變化可誘導(dǎo)炎癥微環(huán)境的形成，其代謝產(chǎn)物可能促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。癌癥的重要特征之一是細(xì)胞惡性增殖和轉(zhuǎn)移，表現(xiàn)為細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的提高。本研究發(fā)現(xiàn)，SGM具有更強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力，且雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能抑制這種作用，提示SG可能在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中也起有促進(jìn)作用。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、極性、胚胎發(fā)育過(guò)程和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用，其異常激活可導(dǎo)致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生[18-19]。β-catenin、c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)通路核心的下游靶基因，其過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)DNA復(fù)制能力，促進(jìn)DNA增殖[20]。本研究結(jié)果顯示，SGM組和雙歧桿菌代謝產(chǎn)物+SGM組β-catenin蛋白表達(dá)、c-myc mRNA表達(dá)均明顯高于其余三個(gè)組別，提示SGM可激活Wnt信號(hào)通路，且雙歧桿菌代謝產(chǎn)物并不能抑制這種激活，并可能進(jìn)一步調(diào)控下游腫瘤相關(guān)基因的表達(dá)。

綜上所述，本研究從細(xì)胞增殖、Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白β-catenin蛋白表達(dá)以及下游分子c-myc mRNA表達(dá)上闡述了SGM對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控作用，為腸道微生物與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的研究奠定了一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。下一步應(yīng)從腫瘤組織標(biāo)本中進(jìn)一步探討SG與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，以期為結(jié)腸癌的防治探索一種新的生物靶點(diǎn)。