杜曉博 趙美華 馬 娜 高 闖 楊貝貝 王丹丹 耿 麗 王許平 馮百歲

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 吳階平醫(yī)學(xué)基金會(huì)中國(guó)炎癥性腸病聯(lián)盟河南省炎癥性腸病中心(450014)

背景：C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員D(CLEC4D)在系統(tǒng)性真菌感染中可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，調(diào)控IL-17A表達(dá)，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)其在腸道免疫中是否發(fā)揮作用的報(bào)道。目的：探討CLEC4D、CARD9在炎癥性腸病(IBD)患者結(jié)腸組織中的表達(dá)情況及其臨床意義。方法：收集2016年10月—2018年6月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院收治的IBD患者48例，其中潰瘍性結(jié)腸炎(UC)患者36例，克羅恩病(CD)患者12例，以30例結(jié)腸癌旁正常組織作為對(duì)照。采用免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織中CLEC4D和CARD9表達(dá)，并分析其與臨床特征的相關(guān)性。結(jié)果：UC組、CD組結(jié)腸組織中CLEC4D和CARD9表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而UC組與CD組之間無(wú)明顯差異(P>0.05)。UC組CLEC4D、CARD9表達(dá)與Mayo評(píng)分、Baron分級(jí)呈正相關(guān)(P<0.05)，CD組CLEC4D、CARD9表達(dá)與CDAI評(píng)分呈正相關(guān)(P<0.05)，與SES-CD評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；IBD患者CLEC4D、CARD9表達(dá)與CRP呈正相關(guān)(P<0.05)，而與ESR無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論：CLEC4D、CARD9在IBD患者中的表達(dá)升高，且與患者病情密切相關(guān)，CLEC4D可能通過(guò)CARD9相關(guān)途徑參與IBD的腸道免疫。

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn’s disease, CD)，其是一種病因不明的慢性非特異性消化道炎癥性疾病，目前認(rèn)為腸道微生物、免疫功能異常在IBD的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用。腸道微生態(tài)包括細(xì)菌、真菌、病毒等，目前關(guān)于細(xì)菌在IBD中的研究較多，而相關(guān)真菌的研究較少[1]。現(xiàn)有研究表明無(wú)論是小鼠DSS結(jié)腸炎模型還是IBD患者，其腸道真菌數(shù)量和多態(tài)性均發(fā)生變化，表明真菌在IBD中發(fā)揮一定作用，但具體作用機(jī)制仍不清楚[2]。

C型凝集素(C-type lectins)是模式識(shí)別受體的重要組成部分，在抵御真菌感染、介導(dǎo)免疫炎癥過(guò)程中起有重要作用[3]。C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員D(C-type lectin domain family 4 member D, CLEC4D)是最近發(fā)現(xiàn)的C型凝集素家族成員，可特異性識(shí)別真菌細(xì)胞壁成分α-甘露聚糖，誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，參與抗真菌反應(yīng)[4]。胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein 9, CARD9)在真菌、分枝桿菌的先天性免疫中發(fā)揮作用。在C型凝集素介導(dǎo)的全身性真菌感染中，CARD9可將先天性免疫與Th17細(xì)胞分化聯(lián)系起來(lái)，起關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[5]。此外，CARD9的某些遺傳變異可增加真菌感染風(fēng)險(xiǎn)。

目前CLEC4D、CARD9在人體胃腸道免疫中是否起作用仍不清楚。本研究通過(guò)檢測(cè)IBD患者中CLEC4D、CARD9的表達(dá)情況，旨在探討其在IBD中的作用及其可能的機(jī)制。

材料與方法

一、一般資料

收集2016年10月—2018年6月鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院門診和住院IBD患者48例，其中UC患者36例，CD患者12例。IBD的診斷符合2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)消化病學(xué)分會(huì)炎癥性腸病學(xué)組制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。48例IBD患者中，男性22例，女性26例；年齡15～69歲，平均(42.3±15.8)歲，且近4個(gè)月內(nèi)未接受過(guò)激素、免疫抑制劑、生物制劑治療，未合并其他自身免疫病。以同期30例行外科手術(shù)切除的結(jié)腸癌旁正常組織(距癌組織5 cm以上)作為對(duì)照，均經(jīng)病理檢查證實(shí)。其中男性17例，女性13例；年齡42～76歲，平均(52.2±12.2)歲。本研究方案通過(guò)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，入選者均簽署知情同意書(shū)，。

二、方法

1. 免疫組化法檢測(cè)結(jié)腸組織CLEC4D、CARD9表達(dá)：組織切片經(jīng)脫蠟，梯度乙醇水化，抗原高壓修復(fù)，抗原封閉，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加兔抗人多克隆抗體CLEC4D (美國(guó)Abcam公司，稀釋比例為1∶500)、CARD9(Cloud-Clone公司，稀釋比例為1∶500)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；滴加二抗，DAB顯色；蘇木素復(fù)染，分化，封片。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

結(jié)果判斷：細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞。高倍(×400)視野下，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)選取5個(gè)視野，取均值。每張切片由兩名病理科醫(yī)師分別計(jì)數(shù)，雙盲下進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0～5%，0分；6%～25%，1分；26%～50%，2分；51%～75%，3分；>75%，4分。染色強(qiáng)度：無(wú)著色，0分；淺黃色，1分；棕黃色，2分；黃褐色，3分。染色總評(píng)分為陽(yáng)性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度之積，0分，陰性；1～4分，弱陽(yáng)性；5～8分，陽(yáng)性；9～12分，強(qiáng)陽(yáng)性。

2. 疾病活動(dòng)性、內(nèi)鏡表現(xiàn)評(píng)估：CD患者疾病活動(dòng)性評(píng)估采用Best CD活動(dòng)指數(shù)，內(nèi)鏡下表現(xiàn)評(píng)估采用SES-CD評(píng)分[7]；UC患者疾病活動(dòng)性評(píng)估采用改良Mayo評(píng)分系統(tǒng)，內(nèi)鏡下表現(xiàn)采用Baron量表分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)估[8]；同時(shí)收集患者初次住院時(shí)的ESR、CRP。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者的一般情況

36例UC患者中，CLEC4D弱陽(yáng)性表達(dá)15例，陽(yáng)性15例，強(qiáng)陽(yáng)性6例；CARD9弱陽(yáng)性表達(dá)9例，陽(yáng)性21例，強(qiáng)陽(yáng)性6例。12例CD患者中，CLEC4D弱陽(yáng)性表達(dá)4例，陽(yáng)性2例，強(qiáng)陽(yáng)性6例；CARD9弱陽(yáng)性表達(dá)2例，陽(yáng)性6例，強(qiáng)陽(yáng)性4例。各組患者疾病活動(dòng)性評(píng)分、內(nèi)鏡下表現(xiàn)評(píng)分、ESR、CRP結(jié)果見(jiàn)表1。

二、各組結(jié)腸組織CLEC4D、CARD9表達(dá)情況

各組結(jié)腸組織CLEC4D、CRAD9表達(dá)情況見(jiàn)圖1、圖2。與對(duì)照組相比，UC、CD組CLEC4D、CARD9表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，而UC組與CD組之間相比無(wú)明顯差異(P>0.05)(表2)。

三、CLEC4D、CARD9表達(dá)與患者臨床特征關(guān)系

UC組CLEC4D、CARD9表達(dá)與Mayo評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.331，P<0.05；r=0.379，P<0.05)，與Baron分級(jí)亦呈正相關(guān)(r=0.330，P<0.05；r=0.334，P<0.05)；CD組患者CLEC4D、CARD9表達(dá)與CDAI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.588，P<0.05；r=0.636，P<0.05)，與SES-CD評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.332，P>0.05；r=0.428，P>0.05)。

IBD患者CLEC4D、CARD9表達(dá)與CRP呈正相關(guān)(r=0.689，P<0.01；r=0.302，P=0.037)，而與ESR無(wú)明顯相關(guān)性(r=0.376，P=0.137；r=0.282，P=0.060)。

表2 各組CLEC4D和CARD9評(píng)分比較

*與對(duì)照組比較，P<0.05

討 論

IBD患者的腸道微生態(tài)發(fā)生了改變，其中真菌的改變主要表現(xiàn)為機(jī)會(huì)致病菌數(shù)量增多，主要包括念珠菌屬、毛孢子菌屬和釀酒酵母菌[9]。Jawhara等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，給予DSS結(jié)腸炎小鼠白念珠菌灌胃后，腸道組織中髓過(guò)氧化物酶以及腫瘤壞死因子(TNF)-α增加，腸道炎癥反應(yīng)加重。Qiu等[11]給予DSS結(jié)腸炎小鼠氟康唑治療后，體質(zhì)量較對(duì)照組明顯降低，結(jié)腸明顯縮短。上述研究表明腸道真菌在IBD的發(fā)生、發(fā)展中起有重要作用，但其具體的作用機(jī)制楚尚未完全清楚。

CLEC4D、CARD9是機(jī)體抵抗真菌感染的關(guān)鍵分子。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，UC、CD患者結(jié)腸組織中CLEC4D、CARD9表達(dá)均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示CLEC4D、CARD9可能在IBD的發(fā)生中起有作用。UC主要由Th2細(xì)胞引起，而CD主要與Th1細(xì)胞相關(guān)，兩者的發(fā)病機(jī)制存在明顯差異。目前認(rèn)為Th17細(xì)胞和IL-17在IBD中起有重要的促炎作用。在系統(tǒng)性免疫中CLEC4D主要通過(guò)Syk-CARD9-Bcl-10通路，介導(dǎo)NF-κB誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，從而發(fā)揮抗感染的作用[12]。Wang等[13]以DSS誘導(dǎo)CLEC4D缺陷小鼠結(jié)腸炎，結(jié)果顯示與野生型小鼠相比，其炎癥反應(yīng)加重，腸道中熱帶念珠菌數(shù)量增加，Th17細(xì)胞減少，IL-17表達(dá)降低等。提示CLEC4D可能通過(guò)誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化和IL-17表達(dá)發(fā)揮作用。后續(xù)研究將檢測(cè)IBD患者結(jié)腸組織或外周血中IL-17表達(dá)，并進(jìn)一步分析其與CLEC4D、CARD9的關(guān)系，從而探討CLEC4D可能的作用機(jī)制。

表1 CD和UC患者疾病活動(dòng)性、內(nèi)鏡下評(píng)分、ESR和CRP結(jié)果

A：對(duì)照組；B：UC組；C：CD組

A：對(duì)照組；B：UC組；C：CD組

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，UC組CLEC4D、CARD9表達(dá)與Mayo評(píng)分、Baron分級(jí)呈正相關(guān)；CD組CLEC4D、CARD9表達(dá)與CDAI評(píng)分呈正相關(guān)，但與SES-CD評(píng)分無(wú)明顯相關(guān)性。SES-CD評(píng)分系統(tǒng)主要根據(jù)CD患者結(jié)腸鏡結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，而CD則可發(fā)生于整個(gè)消化道，同時(shí)部分患者存在因嚴(yán)重狹窄而結(jié)腸鏡無(wú)法通過(guò)的情況，影響了SES-CD評(píng)分對(duì)CD患者總體狀況的評(píng)估。但總體而言，CLEC4D表達(dá)與IBD患者病情嚴(yán)重程度呈明顯正相關(guān)。

本研究還發(fā)現(xiàn)，IBD患者CLEC4D、CARD9表達(dá)與CRP呈正相關(guān)，而與ESR無(wú)明顯相關(guān)性。雖然ESR和CRP是評(píng)估炎癥程度的重要血清學(xué)指標(biāo)，但既往研究發(fā)現(xiàn)與ESR相比，CRP能更好地反映中-重度IBD的活動(dòng)性[14]，本研究中，中-重度UC、CD患者占84%，這可能是造成該結(jié)果的原因之一，同時(shí)也不能排除樣本過(guò)少導(dǎo)致的實(shí)驗(yàn)誤差。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CLEC4D、CARD9在IBD患者中的表達(dá)升高，且與患者病情嚴(yán)重程度相關(guān)，CLEC4D可能通過(guò)CARD9相關(guān)途徑參與IBD的腸道免疫，但機(jī)制仍不明確，應(yīng)行進(jìn)一步研究闡明其具體的作用方式。