陳艷波 孔德嘉 張金鋒 馬志剛

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤[1]。大約60%的乳腺癌患者為雌激素受體陽性(Estrogen-receptor positive，ER+)的患者，該類乳腺癌依賴雌激素信號(hào)刺激腫瘤生長[2]。他莫昔芬(Tamoxifen，TAM)作為選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑，可以通過對(duì)抗腫瘤細(xì)胞中的雌激素受體來抑制腫瘤細(xì)胞增殖，從而提高乳腺癌患者的生存率[3-4]。在以往的臨床治療中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬的反應(yīng)性存在很大的個(gè)體差異，部分患者可能出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象[5]。但是目前仍然缺少敏感的生物學(xué)標(biāo)志物來預(yù)測他莫昔芬的療效。

已有研究表明，CYP2D6的基因多態(tài)性與他莫昔芬在患者體內(nèi)的代謝和療效明顯相關(guān)。因此，本研究在當(dāng)前的研究中探索CYP2D6的三種基因多態(tài)性(rs16947，rs1065852，rs28371725)與他莫昔芬三種代謝產(chǎn)物在患者血液中濃度的相關(guān)性，希望本研究能夠?yàn)楹罄m(xù)預(yù)測他莫昔芬療效提供科學(xué)依據(jù)，從而更加科學(xué)的指導(dǎo)臨床患者用藥。

1 材料與方法

1.1 研究人群

本研究選取2010年1月—2012年12月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院乳腺外科就診的乳腺癌患者198例，這些患者均通過病理診斷確診為乳腺癌，并且這些患者在術(shù)后應(yīng)用他莫昔芬進(jìn)行內(nèi)分泌治療。經(jīng)醫(yī)生和患者同意后，對(duì)病人進(jìn)行術(shù)前采集血液樣本，并對(duì)血液樣本進(jìn)行下一步檢測。

1.2 研究方法

1.2.1 熒光定量PCR基因型鑒定 使用Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取外周血DNA，利用NanoDrop2000c儀器定量測定DNA濃度及OD值，質(zhì)量合格的DNA用0.5 mL EP管分裝，-20℃凍存?zhèn)溆谩aqman探針法基因分型：探針在life technology公司訂購，熒光定量PCR反應(yīng)體系如表1。

表1 熒光定量PCR體系及條件Table 1 Reaction system and condition of real time PCR

1.2.2 超高液相色譜儀串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀檢測他莫昔芬三種代謝產(chǎn)物濃度 定量檢測TAM三種代謝產(chǎn)物的濃度：4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM、4-OH-TAM。4-OH-TAM的母離子為388.2，子離子為72.1，錐孔電壓為30 V，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為20、40、80、200和600 ng/mL；4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM的母離子均為374.3，子離子為129，但是保留時(shí)間分別為3.7 min和4.2 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍為50、100、200、500、1000和1500 ng/mL。

1.3 實(shí)驗(yàn)質(zhì)量控制

全部實(shí)驗(yàn)在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院分子流行病學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。所有進(jìn)行基因分型的DNA樣本都通過試劑盒進(jìn)行提取。實(shí)驗(yàn)操作過程在冰盤上操作完成。基因分型使用羅氏熒光定量PCR檢測系統(tǒng)。在每96孔板中隨機(jī)選擇1～2個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)SNP信號(hào)都是在滿足形成三個(gè)明顯分型點(diǎn)聚集簇的情況下，完成基因型分析，并給出報(bào)告。對(duì)于每個(gè)SNP位點(diǎn)，隨機(jī)選擇5%的樣本進(jìn)行復(fù)測。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Shapiro-Wilk法對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布，選用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，并進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 液質(zhì)聯(lián)用檢測他莫昔芬代謝產(chǎn)物

他莫昔芬代謝產(chǎn)物4-OH-TAM的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0013x+8.5298，R2=0.998；他莫昔芬其他兩種代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別為y=0.042x+9.291，R2=0.9995；y=0.0319x+3.115，R2=0.9975。建立的檢測方法具有良好的線性范圍和相關(guān)系數(shù)，能夠滿足他莫昔芬代謝產(chǎn)物檢測的需要。

2.2 SNP位點(diǎn)與他莫昔芬代謝產(chǎn)物濃度的關(guān)系

不同基因型患者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度經(jīng)過Shapiro-Wilk法分析后，P值均小于0.05，不符合正態(tài)分布。因此，以上數(shù)據(jù)需采用非參數(shù)檢驗(yàn)的獨(dú)立樣本Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析，并用中位數(shù)和變異區(qū)間進(jìn)行描述(表2-4)。

2.3 各SNP位點(diǎn)不同基因型攜帶者他莫昔芬藥物代謝濃度的差異

rs16947位點(diǎn)三種基因型之間相比，應(yīng)用他莫昔芬后產(chǎn)生的4-OH-TAM的濃度并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.704)，而4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM的濃度均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.049)。對(duì)4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM兩種代謝產(chǎn)物在各基因型組間的差異進(jìn)行兩兩比較，經(jīng)多重檢驗(yàn)校正后發(fā)現(xiàn)，純合變異型和純和野生型之間相比，代謝產(chǎn)物濃度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.014)，AG及GG基因型之間相比，同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.008)。以上結(jié)果表明該位點(diǎn)不同基因型與代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM在血液中濃度有關(guān)，因此該SNP位點(diǎn)可能參與了患者他莫昔芬的代謝過程(表5)。

此外，rs1065852位點(diǎn)和rs28371725位點(diǎn)上的變異與代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM、4′OH-N-D-TAM和4-OH-TAM的含量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明這些SNP位點(diǎn)的多態(tài)性并未參與他莫昔芬的代謝過程。

表2 rs16947不同基因型攜帶者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度(ng/mL)Table 2 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs16947(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表3 rs1065852不同基因型攜帶者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度(ng/mL)Table 3 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs1065852(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表4 rs28371725不同基因型攜帶者他莫昔芬代謝產(chǎn)物的濃度(ng/mL)Table 4 The metabolites concentrations(ng/mL)of Tamoxifen in different genotypes of rs28371725(ng/mL)

Note：*Pvalue stands for normality test，P<0.05 does not conform to normal distribution.

表5 rs16947不同基因型間他莫昔芬代謝產(chǎn)物濃度的比較分析Table 5 The correlation among the metabolites concentrations(ng/ml)of Tamoxifen in different genotypes of rs16947

3 討論

內(nèi)分泌治療是ER陽性乳腺癌患者治療的重要組成部分，他莫昔芬作為內(nèi)分泌治療藥物已有30年的歷史，現(xiàn)在仍然是該亞型患者輔助治療的標(biāo)準(zhǔn)藥物，可以降低患者復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險(xiǎn)。在臨床治療過程中，僅僅約50%的患者對(duì)他莫昔芬治療有所獲益，嚴(yán)重影響了患者的預(yù)后。他莫昔芬的代謝過程在肝臟中進(jìn)行，經(jīng)過P450 3A4/5和CYP2D6介導(dǎo)，形成N-去甲基TAM(N-desmethyl tamoxifen，NDM-TAM)，4-羥基TAM(4-Hydroxy tamoxifen，4-OH-TAM)和4-羥基-N-去甲基TAM(4-Hydroxy-desmethyl tamoxifen，4-OH-N-D-TAM)三種代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物與ER的親和力明顯提高，可以更顯著的抑制ER陽性乳腺癌細(xì)胞的增殖[6-8]。

CYP2D6是他莫昔芬代謝過程中的一種關(guān)鍵酶，研究顯示，CYP2D6存在約100種基因突變位點(diǎn)，這些突變與他莫昔芬代謝活性明顯相關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺癌患者對(duì)他莫昔芬反應(yīng)出現(xiàn)明顯差異[9-11]。根據(jù)CYP2D6等位基因的不同變異和組合，將患者分為4組代謝表型：低代謝型(Poor metabolizers，PMs)、中間代謝型(Intermediate metabolizers，IMs)、泛代謝型(Extensive metabolizers，EMs)和超速代謝型(Ultrarapid metabolizers，UMs)[12]。有研究表明，給予乳腺癌細(xì)胞他莫昔芬時(shí)，活性代謝產(chǎn)物4-OH-N-D-TAM的濃度在IMs和EMs中比較高，其對(duì)乳腺癌細(xì)胞的抑制效果也更好[13]。因此，CYP2D6不同位點(diǎn)的變異可以影響他莫昔芬的活性和療效。

CYP2D6基因多態(tài)性個(gè)體差異顯著，歐美國家最常見的是CYP2D6*4，而亞洲人群最主要的變異體為CYP2D6*10[14]。研究表明CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2D6*5、CYP2D6*6的雜合子或純合子可以影響乳腺癌患者4-OH-N-D-TAM的濃度[15]。Xu等發(fā)現(xiàn)攜帶CYP2D6*10等位基因*10/*10的患者，其血中4-OH-N-D-TAM的水平較低[16]。

多項(xiàng)研究表明，CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬的體內(nèi)代謝相關(guān)，進(jìn)而可能會(huì)對(duì)乳腺癌患者的生存產(chǎn)生影響，但由于研究位點(diǎn)不同，研究結(jié)果間存在一定的爭議。如Okishiro等[17]分析發(fā)現(xiàn)CYP2D6基因多態(tài)性與乳腺癌患者的無病生存率無相關(guān)性，Rae也得到了相似的結(jié)果，對(duì)他莫昔芬治療的乳腺癌患者隨訪10年，結(jié)果表明CYP2D6基因型與患者無病生存率無相關(guān)性[18]。而一項(xiàng)Meta分析表明，在使用他莫昔芬的乳腺癌患者中，不同的CYP2D6基因型會(huì)影響患者的生存[19]。因此，進(jìn)行大樣本、多中心的研究可能會(huì)為臨床用藥提供更可靠的依據(jù)。

我國乳腺癌疾病的現(xiàn)狀表明，雌激素受體陽性的患者占所有乳腺癌患者的60%～70%，針對(duì)雌激素受體陽性的患者進(jìn)行的內(nèi)分泌治療，成為全身治療的重要手段，他莫昔芬可以廣泛應(yīng)用于雌激素受體陽性的患者，因此，近年來針對(duì)于CYP2D6基因多態(tài)性與他莫昔芬代謝及療效的研究受到了廣泛的關(guān)注。由于CYP2D6活性下降，有可能引起他莫昔芬療效下降，針對(duì)當(dāng)前實(shí)驗(yàn)，研究CYP2D6與該基因SNP位點(diǎn)的相關(guān)性就變得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)分析了乳腺癌患者CYP2D6三個(gè)SNP位點(diǎn)(rs16947，rs1065852，rs28371725)基因型和他莫昔芬血液中藥物代謝產(chǎn)物濃度之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CYP2D6基因的SNP rs16947與4-OH-N-D-TAM和4′OH-N-D-TAM在血液中的濃度相關(guān)。因此，該位點(diǎn)可能參與了他莫昔芬在體內(nèi)代謝的過程，在乳腺癌患者使用他莫昔芬前，檢測分析CYP2D6基因型以及其相應(yīng)的代謝類型，預(yù)測他莫昔芬的療效，對(duì)指導(dǎo)臨床患者他莫昔芬用藥具有重要意義。

目前關(guān)于CYP2D6基因與ER陽性乳腺癌患者他莫昔芬治療的預(yù)后尚存爭議，所以，需要針對(duì)大樣本量及長期隨訪的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，分析其對(duì)患者預(yù)后的影響，以期望能夠指導(dǎo)ER陽性乳腺癌患者進(jìn)行精準(zhǔn)的內(nèi)分泌治療，提高患者的內(nèi)分泌治療效果。