徐洋 李文華 鄭迪 張權(quán)

(1東南大學(xué)附屬徐州市中心醫(yī)院心內(nèi)科，江蘇 徐州 221000；徐州醫(yī)科大學(xué) 2心血管病研究所；3附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科)

隨著冠心病的診斷、介入和放射醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展，對(duì)比劑的使用日益增多。對(duì)比劑急性腎損傷(CI-AKI)逐漸成為醫(yī)源性腎衰竭的常見(jiàn)原因之一〔1〕。同時(shí)，CI-AKI、支架內(nèi)血栓和支架術(shù)后再狹窄是患者行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)手術(shù)后的3大并發(fā)癥〔2〕。CI-AKI的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確,對(duì)比劑的直接腎小管細(xì)胞毒性損傷、對(duì)比劑引起氧自由基損傷和腎臟血流動(dòng)力學(xué)變化是其重要機(jī)制〔3,4〕。蝦青素(AST)是一種類(lèi)胡蘿卜素，有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)糖脂代謝、減輕肝腎損傷等多種作用〔5〕。目前CI-AKI的研究多集中在動(dòng)物水平和臨床研究，本實(shí)驗(yàn)旨在體外建立CI-AKI模型，研究細(xì)胞凋亡機(jī)制在大鼠CI-AKI中的作用及AST對(duì)其凋亡的保護(hù)，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 AST(Sigma，純度>99%)，碘海醇(I，揚(yáng)子江藥業(yè)有限公司)，胎牛血清(四季青，中國(guó))，DMEM/F12(Hyclone,美國(guó))，煙酰胺(大連美侖生物技術(shù)有限公司，中國(guó))，二喹啉甲酸(BCA)蛋白試劑盒，膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-FITC/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，線(xiàn)粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1，江蘇碧云天生物技術(shù)公司)，β-actin抗體(美國(guó)Proteintech公司)，沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(SIRT)1抗體(Absin生物技術(shù)有限公司)，P53抗體(Abclonal生物技術(shù)有限公司)，Bax抗體(美國(guó)Proteintech公司)，Bcl-2抗體(美國(guó)SantaCruz公司)，CO2培養(yǎng)箱(Heraeus公司),三氣培養(yǎng)箱(Thermo 公司),酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司),蛋白電泳及電轉(zhuǎn)裝置(Bio-Rad 公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 大鼠腎小管上皮細(xì)胞株(NRK-52E)在含10%胎牛血清、0.1%青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代。傳代后隨機(jī)分組：空白對(duì)照(Control)組、溶劑對(duì)照(DMSO)組(0.1% DMSO)、I組(50 g I/L)、AST預(yù)處理(AST+I)組(50 g I/L I+20 μmol/L AST)、AST預(yù)處理+SIRT1抑制劑煙酰胺(AST+I+NA)組(50 g I/L I+20 μmol/L AST+20 mmol/L NA)，I+SIRT1抑制劑(I+NA)組(50 g I/L I+20 mmol/L NA)。

1.34，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)熒光染色觀察細(xì)胞核形態(tài) 將生長(zhǎng)于24孔培養(yǎng)板中的大鼠腎小管上皮細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，4%多聚甲醛〔溶于0.1 mol/L磷酸緩沖液(PB)，pH7.4〕室溫固定15 min后，再次用PBS清洗3次×5 min，避光條件下加入3 ml DAPI(用含0.2%Triton的PBS溶解)染色5～10 min，PBS沖洗3遍×5 min。在Olympus熒光顯微鏡上，以400 nm為激發(fā)光，455 nm發(fā)射光觀察。

1.4Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 用2 ml PBS輕輕潤(rùn)洗培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，去除PBS。將細(xì)胞重新懸浮于之前的培養(yǎng)基中或預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液中使其細(xì)胞濃度為1×106細(xì)胞/ml。取500 μl細(xì)胞懸液(5×105個(gè)細(xì)胞)至離心管中，離心1 000 r/min×5 min，去上清，加入500 μl PBS洗滌細(xì)胞，離心，去上清。再加入500 μl的1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，離心，去上清；加入100 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl Annexin V-APC室溫避光反應(yīng)15 min。加入500 μl的1×結(jié)合緩沖液洗滌細(xì)胞，離心，去上清；加入200 μl 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl PI。將樣品在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)試 棄去6孔板中的培養(yǎng)基，用PBS液洗滌3次，加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每1 ml JC-1染色緩沖液(5×)加入4 ml蒸餾水的比例，配制適量的 JC-1染色緩沖液(1×)，并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用 JC-1染色緩沖液(1×)洗滌2次，加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，在熒光顯微鏡下觀察。檢測(cè) JC-1單體時(shí)激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測(cè) JC-1聚合物時(shí)激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜后室溫下封閉，用特異性抗體進(jìn)行免疫雜交檢測(cè)，β-actin作為內(nèi)參，化學(xué)發(fā)光劑顯色，最后對(duì)目的條帶進(jìn)行掃描密度分析。每組重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism5.0 軟件進(jìn)行方差分析、q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化 Control組與DMSO組，細(xì)胞核染色均一，未見(jiàn)凋亡細(xì)胞。I組可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、核深染，固縮的核呈高亮狀態(tài)，部分細(xì)胞可見(jiàn)核裂解。與I組相比，AST+I組核固縮、核深染狀態(tài)改善，凋亡細(xì)胞減少。AST+I+NA組與AST+I組相比，固縮高亮的核增多，凋亡細(xì)胞增加。與AST+I+NA組相比，I+NA組凋亡小體進(jìn)一步增加，細(xì)胞損傷加重。見(jiàn)圖1。

2.2各組細(xì)胞凋亡率比較 與Control組相比，DMSO組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；I組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。AST+I組細(xì)胞凋亡率較I組顯著降低(P<0.05)。與AST+I組相比，AST+I+NA組細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。與AST+I+NA比較，I+NA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，I組無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3各組JC-1熒光強(qiáng)度比較 DMSO組和Control組JC-1熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，I組較Control組JC-1熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.05)。AST+I組JC-1熒光強(qiáng)度較 I組顯著升高(P<0.05)。與AST+I+NA組相比，AST+I組熒光強(qiáng)度顯著升高(P<0.05)，I+NA組JC-1熒光強(qiáng)度顯著降低(P<0.05)。AST+I+NA組與 I組JC-1熒光強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1，圖2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化(×200)

2.4各組腎小管上皮細(xì)胞中蛋白表達(dá)變化 與Control組相比，DMSO組蛋白表達(dá)無(wú)差異(P>0.05)，I組SIRT1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，P53、Bax表達(dá)均顯著增加(P<0.05)。AST+I組細(xì)胞SIRT1、Bcl-2蛋白表達(dá)較I組明顯增加，P53、Bax蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)。AST+I+NA組與AST+I組相比，SIRT1、Bcl-2蛋白含量明顯減少，P53、Bax表達(dá)均明顯增加(P<0.05)。與AST+I+NA組相比，I+NA組SIRT1、Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少，Bax、P53蛋白的表達(dá)顯著增加(P<0.05)。見(jiàn)表1，圖3。

表1 各組細(xì)胞凋亡率和JC-1熒光強(qiáng)度及SIRT1、P53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

與Control組比較：1)P<0.05；與I組比較：2)P<0.05；與AST+I組比較：3)P<0.05；與AST+I+NA組比較：4)P<0.05

圖2 各組JC-1熒光強(qiáng)度比較(×200)

1～6：Control組、DMSO組、I組、AST+I組、AST+I+NA組、I+NA組圖3 Western印跡檢測(cè)各組SIRT1、P53、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)

3 討 論

AST是一種天然存在的紅色類(lèi)胡蘿卜素衍生物,廣泛存在于多種動(dòng)物及植物中。天然AST存在多種潛能,如抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長(zhǎng)、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病等〔6〕。Guo等〔7〕研究表明，AST通過(guò)調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體途徑促凋亡蛋白而減少腎小管細(xì)胞凋亡改善嚴(yán)重?zé)齻笫蟮募毙阅I損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí):AST預(yù)處理可明顯減輕對(duì)比劑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，其腎臟保護(hù)作用與激活SIRT1，穩(wěn)定線(xiàn)粒體膜電位，并調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白P53、Bax、Bcl-2表達(dá)密切相關(guān)。

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞接受刺激信號(hào)并受基因調(diào)控的一種自主性、程序性死亡〔8〕。Bcl-2家族是線(xiàn)粒體途徑細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵,以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和以Bax為代表的促凋亡蛋白可通過(guò)激活一系列下游靶分子,調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜的通透性和完整性,進(jìn)而調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體促凋亡因子的釋放介導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕。研究發(fā)現(xiàn)，P53可調(diào)節(jié)Bcl-2家族進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡〔10〕。P53的靶基因編碼多種促凋亡蛋白,如P53誘導(dǎo)基因蛋白(PIGs)、凋亡蛋白1(Fas)、凋亡酶激活因子(Apaf)-1、Bax、P53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子(PUMA)等,P53作為一種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),促使細(xì)胞凋亡發(fā)生〔11〕。P53也能直接結(jié)合Bak并將其激活,誘導(dǎo)Bak寡聚化,繼而誘導(dǎo)細(xì)胞色素(Cyt)c釋放最終引起細(xì)胞凋亡〔12,13〕。

SIRT1是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依賴(lài)的第三類(lèi)組蛋白去乙?；浮?4〕。SIRT1的下游效應(yīng)分子包括組蛋白、P53、核因子(NF)-κB、過(guò)氧化物酶增殖物激活受體(PPAR)γ及輔助激活因子(PGC-1α)、叉頭蛋白轉(zhuǎn)錄因子(FOXOs)、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)1等,通過(guò)將它們?nèi)ヒ阴；_(dá)到調(diào)節(jié)糖脂代謝、抑制氧化應(yīng)激和炎癥、減少凋亡、減輕衰老等生物學(xué)效應(yīng),在腫瘤、糖脂代謝穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和心血管等多種疾病中發(fā)揮重要作用〔15,16〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明AST是通過(guò)激活SIRT1信號(hào)保護(hù)NRK-52E細(xì)胞，且SIRT1是在這些分子的上游發(fā)揮作用的。此外，與AST+I+NA組相比，I+NA組缺少了AST的保護(hù)，SIRT1、Bcl-2蛋白表達(dá)減少， P53、Bax表達(dá)增多，結(jié)果再次證實(shí)了AST的保護(hù)作用。

綜上所述，AST可以改善CI-AKI，其主要機(jī)制是通過(guò)激活SIRT1通路，調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體膜電位，下調(diào)促凋亡蛋白P53、Bax表達(dá)，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用。AST為對(duì)比劑腎病(CIN)的防治提供了新的選擇，但AST產(chǎn)生腎保護(hù)性作用的具體機(jī)制尚未完全闡明，仍需進(jìn)一步研究。