曾 臻，倪健斌，史 博，譚強(qiáng)來(lái)*

(1.廈門醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361023；2.廈門大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361102)

福建牡蠣(Crassostreaangulata)是我國(guó)南方貝類養(yǎng)殖的主要種類，近年來(lái)其商業(yè)價(jià)值不斷增加，對(duì)福建牡蠣生殖調(diào)控的研究在養(yǎng)殖中具有重要的應(yīng)用價(jià)值[1]。此外，牡蠣是分析河口污染情況的環(huán)境指示種，養(yǎng)殖環(huán)境中大量的污染物可以通過(guò)擾亂牡蠣的內(nèi)分泌調(diào)節(jié)影響牡蠣的生理活動(dòng)，因此對(duì)牡蠣內(nèi)分泌機(jī)制的研究顯得格外重要。然而目前國(guó)內(nèi)外有關(guān)貝類生殖內(nèi)分泌的研究卻十分有限。

類固醇激素(Steroid hormone)是最主要的一類性腺激素，包括雄激素、雌激素和孕酮等。目前，在包括頭足綱、雙殼綱和腹足綱在內(nèi)的不少軟體動(dòng)物組織中均檢測(cè)到類似脊椎動(dòng)物性類固醇激素物質(zhì)的存在[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)這些性類固醇激素參與了貝類的生殖調(diào)控，在貝類的性腺發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。然而，關(guān)于類固醇激素在貝類中是如何發(fā)揮作用的機(jī)制還不甚清楚。Wang等[4]用放射性配體結(jié)合實(shí)驗(yàn)的方法在海扇貝(Placopectenmagellanicus)性腺組織中檢測(cè)到2個(gè)雌激素結(jié)合位點(diǎn)，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明這兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)具有特異性結(jié)合雌激素的能力，并且這種作用在配子發(fā)生的早期更加明顯。另外，Wang等[5-6]還發(fā)現(xiàn)用脊椎動(dòng)物類固醇激素受體拮抗劑(如1.25 μM它莫西芬、2.5 μM氟他胺、1.00 μM美服培酮)可以阻斷類固醇激素在海扇貝中的生物學(xué)作用。這些研究結(jié)果表明在貝類中可能同樣存在由雌激素介導(dǎo)的生殖調(diào)節(jié)機(jī)制，并且可能是通過(guò)激活其受體來(lái)發(fā)揮作用的。

研究發(fā)現(xiàn)，貝類中類固醇激素合成的底物與脊椎動(dòng)物同樣是膽固醇和孕烯醇酮[7-8]。但目前有關(guān)貝類中類固醇激素合成和代謝機(jī)制的研究較少，而且比較零散。其中3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-Hydroxysteroid dehydrogenases，3β-HSDs)為類固醇激素合成代謝通路中的一種關(guān)鍵酶。3β-HSD可以催化孕烯醇酮或脫氫表雄酮生成有活性的孕酮和雄烯二酮。研究者在蝸牛(HelixpomatiaL.)[9]、真蛸(Octopusvulgaris)[10]、紫貽貝(Mytilusedulis)[11]和海蛞蝓(Ariolimaxcalifornicus)[12]等軟體動(dòng)物的性腺組織提取物中也檢測(cè)到了3β-HSD的這種活性。此外，Krusch等[9]還發(fā)現(xiàn)蝸牛卵巢中3β-HSD在產(chǎn)卵前的活性明顯高于排卵后，這預(yù)示了其在蝸牛生殖活動(dòng)中的重要功能。

本研究擬通過(guò)對(duì)福建牡蠣性類固醇激素合成相關(guān)酶3β-HSD的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能探究，分析其時(shí)空表達(dá)特征，以及在牡蠣細(xì)胞中的定位，為闡明牡蠣內(nèi)源性類固醇激素的合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究牡蠣生殖內(nèi)分泌機(jī)理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)用福建牡蠣購(gòu)自福建省漳州市斗美村漁排，重量為3.8～14.0 g/只。參考Foighil等[13]和Folmer等[14]的方法，根據(jù)線粒體COI基因片段序列特征進(jìn)行種的鑒定，確定所采樣品為福建牡蠣。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察[15]，將所采樣品分為四個(gè)階段：增殖期、生長(zhǎng)期、繁殖期和排放期，每個(gè)時(shí)期選取15只雄性和15只雌性作為本研究的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。打開(kāi)牡蠣殼后，取每個(gè)時(shí)期牡蠣不同組織(性腺、閉殼肌、外套膜、鰓、內(nèi)臟團(tuán))放入液氮中速凍后保存于-80℃冰箱中備用，同時(shí)取一小塊成熟期性腺組織固定于4%多聚甲醛溶液中(4℃固定過(guò)夜)。

1.2 RNA提取

分別將樣品置于Trizol?Reagent(Invitrogen，USA)勻漿。按照Trizol使用說(shuō)明書，分別從牡蠣不同組織提取總RNA，通過(guò)1%變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，結(jié)合Nanodrop ND-2000分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。

1.3 3β-HSD基因cDNA全長(zhǎng)序列的克隆

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN，China)步驟分別對(duì)所得的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA?；诒緦?shí)驗(yàn)室構(gòu)建的福建牡蠣轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中篩選獲得的3β-HSD基因的序列片段，按照Full-RACE Core Set Ver.2.0 試劑盒(TAKARA，China)要求，分別設(shè)計(jì)并合成5′和3′ RACE特異性引物(引物序列見(jiàn)表1)，按照試劑盒說(shuō)明書對(duì)福建牡蠣3β-HSD基因進(jìn)行5′和3′ RACE擴(kuò)增，將所得序列產(chǎn)物進(jìn)行純化，并送至廣州英韋創(chuàng)津(Invitrogen)生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序分析。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

根據(jù)Quanta cDNA第一鏈合成試劑盒(TIANGEN，China)的說(shuō)明書，以2 μg總RNA為模板，Oligo-dT15為引物，通過(guò)Quanta反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一條鏈。以cDNA第一條鏈為模板，以牡蠣Elongationfactor1α基因(EF1α，GenBank accession No.BQ426516)作為內(nèi)參基因[16]，同時(shí)預(yù)實(shí)驗(yàn)也證明該內(nèi)參基因在福建牡蠣不同組織及不同性腺發(fā)育階段的表達(dá)量十分穩(wěn)定(表1)。運(yùn)用SYBR GreenⅠ染料法在ABI 7500 fast system real-time PCR系統(tǒng)(Applied biosystems，USA)上定量分析不同時(shí)期牡蠣3β-HSD基因的mRNA表達(dá)變化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)平行樣，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。每輪反應(yīng)均設(shè)有cDNA實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組(用DNaseⅠ處理過(guò)，但沒(méi)有進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄的RNA)和空白對(duì)照組(PCR水)。通過(guò)系列梯度稀釋樣品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線法，計(jì)算本次qRT-PCR中所用引物的擴(kuò)增效率E范圍均處在95%～100%(R2>0.99)(表1)。qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)均為150 bp大小的單一產(chǎn)物。本實(shí)驗(yàn)所使用的試劑盒為SYBR Green qPCR Kit(Thermo，USA)，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性95℃ 10 min；95℃ 20 s，52℃ 20 s，72℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后對(duì)每個(gè)基因的熔解曲線進(jìn)行分析。

所得數(shù)據(jù)用ABI 7500 system SDS 軟件(Version 1.4，Applied biosystems)進(jìn)行分析，用2-ΔΔCT法(ΔCt=CtcaVg-CtEF1α，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt校準(zhǔn)組)計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量[17-18]。

1.5 原位雜交

根據(jù)獲得的3β-HSD基因序列，設(shè)計(jì)雜交探針的引物(表1)，參考Ni等[19]的方法對(duì)1.1中固定于4%多聚甲醛溶液中(4℃固定過(guò)夜)的成熟性腺組織進(jìn)行原位雜交。

1.6 目的基因的生物信息學(xué)分析

用BLAST軟件(http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列同源性比對(duì)；用DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)拼接，得到基因的全長(zhǎng)序列；用Compute pI/Mw tool(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)等電點(diǎn)和分子量；用SignalP 3.0 軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)尋找信號(hào)肽；用TMHMM軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域；用Predict Protein 軟件(http：//www.predictprotein.org/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域；用CLUSTALX軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；用MEGA 4.0軟件中的鄰接法(1000 bootstrap replicates)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 福建牡蠣3β-HSD基因的序列全長(zhǎng)及特征

如圖1，福建牡蠣3β-HSD基因(ca3β-HSD)cDNA序列全長(zhǎng)1 444 bp，5′-UTR(5′-Untranslated region)長(zhǎng)165 bp，3′-UTR長(zhǎng)210 bp，開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)長(zhǎng)1 068 bp。該基因可編碼356個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為39.796 kDa，等電點(diǎn)為8.32。經(jīng)SignalP和TMHMM軟件預(yù)測(cè)可知ca3β-HSD的氨基酸序列在AA274～AA296存在1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)。ca3β-HSD的氨基酸序列含有3β-HSD保守的結(jié)構(gòu)域(AA3-AA348)，該結(jié)構(gòu)域包括了1個(gè)酶活性中心YGGTE(AA149～AA153)和1個(gè)輔酶結(jié)合位點(diǎn)TGGAGFLG(AA7～AA14)，其中YGGTE結(jié)構(gòu)是短鏈脫氫酶保守的結(jié)構(gòu)特征。

2.2 福建牡蠣3β-HSD基因的同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

多重序列比對(duì)的結(jié)果表明，ca3β-HSD氨基酸序列與其他動(dòng)物的相似性為33%～99%，其中與太平洋牡蠣(Crassostreagigas)相似性最高(圖2)。用MEGA 4.0軟件以鄰接法(1 000 bootstrap replicates)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析ca3β-HSD與其他物種的同源關(guān)系。進(jìn)化樹(shù)顯示，3β-HSDs分別在脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物聚為兩大枝。而在無(wú)脊椎動(dòng)物中，兩種牡蠣的3β-HSDs最先聚類，接著再與其他無(wú)脊椎動(dòng)物如節(jié)肢動(dòng)物、棘皮動(dòng)物和脊索動(dòng)物等聚類(圖3)。

圖2、3中各物種3β-HSD氨基酸序列在NCBI上的登錄號(hào)如下：太平洋牡蠣(Crassostreagigas)，EKC29143；紫海膽(Strongylocentrotuspurpuratus)，XP_797239；捕食螨(Metaseiulusoccidentalis)，XP_003746390；硬蜱(Ixodesscapularis)，XP_002434360；柱頭蟲(chóng)(Saccoglossuskowalevskii)，XP_002738669；家鼠(Musmusculus)，NP_694873；斑馬魚(Daniorerio)，AY279108；草雀(Taeniopygiaguttata)，NM_001048264；紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)，XM_003962237；非洲爪蟾(Xenopustropicalis)，XM_002940984；紅原雞(Gallusgallus)，NM_205118；稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)，JN858104；青鳉(Oryziaslatipes)，NM_001137565；智人(Homosapiens)，AAA51831；斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)，F(xiàn)J807731；西非低地大猩猩(Gorillagorillagorilla)，XP_004026492。

2.3 福建牡蠣3β-HSD基因在不同組織中的表達(dá)

如圖4所示，3β-HSD基因在福建牡蠣性腺、外套膜、閉殼肌和內(nèi)臟團(tuán)中均有表達(dá)，而在鰓組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)，性腺中3β-HSD基因的表達(dá)量最高，約為其他組織的2～10倍(P<0.05)，卵巢中的表達(dá)量略高于精巢。

注：*表示差異顯著。

Notes:*was significant difference.

2.4 福建牡蠣3β-HSD基因在生殖周期中的表達(dá)模式

圖5反映了福建牡蠣生殖周期中性腺3β-HSD基因的表達(dá)量變化。從增殖期到成熟期，3β-HSD基因的表達(dá)量持續(xù)增高，并在成熟期達(dá)到最大值(P<0.05)，但在配子排放后，其表達(dá)量急劇下降(P<0.05)。3β-HSD基因的這種表達(dá)量變化趨勢(shì)在雌性個(gè)體和雄性個(gè)體中基本一致。

注：不同小寫字母表示差異顯著，相同字母表示無(wú)顯著差異。

Notes:Different lowercase letters indicated significant difference,otherwise the same was no significant olifference.

2.5 福建牡蠣3β-HSD基因在卵巢中的細(xì)胞定位

原位雜交結(jié)果顯示3β-HSD基因在福建牡蠣卵巢中呈現(xiàn)出細(xì)胞定位，能與DIG標(biāo)記的3β-HSD基因的反義RNA探針雜交，顯色后呈藍(lán)黑顏色的陽(yáng)性信號(hào)主要分布在卵細(xì)胞周邊的個(gè)體小的濾泡細(xì)胞上，而在成熟卵細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有陽(yáng)性信號(hào)(圖6)，這說(shuō)明3β-HSD基因主要表達(dá)在福建牡蠣卵巢組織的濾泡細(xì)胞中。

注：a為常規(guī)HE染色結(jié)果；b為用反義探針雜交的陽(yáng)性結(jié)果；c為用正義探針雜交的陰性對(duì)照；Fc為濾泡細(xì)胞；Oo為卵細(xì)胞。

Notes：a was hematoxylin-eosin staining；b was antisense probe；c was sense probe；Fc was follicle cell；Oo was oocyte.

3 討論

3β-HSD可以通過(guò)催化3β位上酮基和羥基間的轉(zhuǎn)化，能分別將孕烯醇酮或脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化為有活性的孕酮和雄烯二酮。催化反應(yīng)分為二步完成，第一步為3β位羥基脫氫，氧化輔酶NAD+為NADH；第二步為NADH激活△5-3-酮類固醇中間體構(gòu)象轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的△4-3-酮類固醇構(gòu)象[20]。脊椎動(dòng)物的3β-HSD具有不同的亞型，如人類3β-HSD具有2種亞型[21]，而大鼠有6種亞型的3β-HSD[22]。不同亞型的3β-HSD具有不同的組織分布特點(diǎn)和生物學(xué)功能，其中人類Ⅱ型3β-HSD和大鼠Ⅰ型、Ⅱ型3β-HSDs主要參與了類固醇激素的合成調(diào)節(jié)[23]。研究者在一些無(wú)脊椎動(dòng)物(如絳蟲(chóng)和孢子蟲(chóng))的體內(nèi)也檢測(cè)到3β-HSD的活性，并發(fā)現(xiàn)它能參與調(diào)節(jié)類固醇激素的合成，對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育具有促進(jìn)作用。海兔、紫貽貝、真蛸和蝸牛等軟體動(dòng)物的性腺組織提取物中也被證明含有能將孕烯醇酮、17α-羥基孕烯酮醇、脫氫表雄酮催化形成孕酮的3β-HSD活性[9-12]。Krusch等[9]還發(fā)現(xiàn)蝸牛卵巢中3β-HSD的活性變化與生殖活動(dòng)緊密聯(lián)系，其在產(chǎn)卵前的活性顯著高于排卵后。以上結(jié)果表明3β-HSD可能同樣參與了貝類中類固醇激素的合成過(guò)程。Zhang等[24]在對(duì)太平洋牡蠣全基因組測(cè)序時(shí)獲得太平洋牡蠣中兩個(gè)亞型的3β-HSDs基因序列，分別是3β-HSD1型和3β-HSD2型，但氨基酸比對(duì)后發(fā)現(xiàn)這兩種亞型的3β-HSD同源性高達(dá)96%。除此之外，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)其他關(guān)于貝類3β-HSD基因研究的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)用基因克隆的方法獲得了福建牡蠣3β-HSD基因全長(zhǎng)序列，這是在貝類中獲得的首個(gè)3β-HSD基因全長(zhǎng)。ca3β-HSD氨基酸序列具有酶活性中心和輔酶結(jié)合位點(diǎn)等結(jié)構(gòu)域，而這些都是3β-HSD家族基因典型的結(jié)構(gòu)特征。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，福建牡蠣3β-HSD與其他物種具有較高的同源性。本次研究發(fā)現(xiàn)，福建牡蠣3β-HSD基因在性腺中高量表達(dá)，這與人、大鼠、鰻魚中Ⅰ型和Ⅱ型3β-HSD基因的組織分布特征相似[23]，也與性腺是貝類重要的生殖內(nèi)分泌器官是相對(duì)應(yīng)的。原位雜交的結(jié)果進(jìn)一步表明其主要表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞上，這與Matsumot等[25]、王丹等[26]、許茜等[27]用免疫組化的方法獲得的結(jié)果一致。此外，3β-HSD基因在福建牡蠣的生殖周期中呈現(xiàn)出與其他部分脊椎動(dòng)物相似的表達(dá)模式[23]，并且與性類固醇激素水平的變化顯著相關(guān)，這預(yù)示了3β-HSD在福建牡蠣性類固醇激素的合成過(guò)程中可能發(fā)揮了重要作用。此外，福建牡蠣3β-HSD基因在雌、雄個(gè)體中表達(dá)量沒(méi)有明顯差別，這可能是由于3β-HSD的催化產(chǎn)物雄烯二酮或孕酮是雌二醇和睪酮合成共同的前體物質(zhì)。

本研究通過(guò)分子生物學(xué)的方法克隆獲得了福建牡蠣性類固醇激素合成酶重要基因3β-HSD的全長(zhǎng)，并研究了其序列結(jié)構(gòu)特征和時(shí)空表達(dá)模式，證明了該基因指導(dǎo)合成的3β-羥化類固醇脫氫酶是牡蠣性類固醇激素合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，對(duì)調(diào)節(jié)牡蠣性類固醇激素的合成起著重要的作用；同時(shí)進(jìn)一步證明了貝類具有合成內(nèi)源性類固醇激素的能力。